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PCR产物纯化回收试剂盒(测序)
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详细内容
中文名称:PCR产物纯化回收试剂盒(测序)
英文名称:
产品规格:100次
产品货号:GOY-F10439
| 本试剂盒利用核酸外切酶I和热敏碱性磷酸酶,仅需简单的保温步骤,方便地去除多余的引物和dNTPs,净化的PCR产物可直接用于测序反应,且不会 损失任何产物。此法可以避免繁琐的胶回收、柱纯化、沉淀、磁珠、过滤、透析等方法,大大节省实验费用及时间。适用于大规模PCR产物净化测序,大幅提高实 操作步骤: 1、取出7.5μl PCR反应混合物; 2、在反应混合物中加入0.5 μl (10 units)的核酸外切酶 I (20000 units/ml), 37℃反应15分钟; 3、再加入1μl的10×AP Buffer 和1μl (5 units) 热敏磷酸酶,37℃反应15分钟;如果反应时间延长,可减少酶用量,需试验验证。热失活核酸外切酶 I和热 敏磷酸酶:80℃保温20分钟,终止反应。反应物可直接用于测序。 操作步骤: 1、取出7.5μl PCR反应混合物; 2、在反应混合物中加入0.5 μl (10 units)的核酸外切酶 I (20000 units/ml), 37℃反应15分钟; 3、再加入1μl的10×AP Buffer 和1μl (5 units) 热敏磷酸酶,37℃反应15分钟;如果反应时间延长,可减少酶用量,需试验验证。热失活核酸外切酶 I和热 敏磷酸酶:80℃保温20分钟,终止反应。反应物可直接用于测序。 本试剂盒为您提供了8 种耐热聚合酶和相应的精心配制的缓冲液,其中缓冲液的pH值,盐离子浓度和助溶剂成分等各不相同,当扩增某些复杂的基因模板等出现问题时,应测试不同的聚合酶及反应缓冲体系。另外,本试剂盒还提供了PCR增剂,能增加引物的特异性,提高DNA聚合酶的热稳定性,适应较宽范围的退火温度和Mg2+浓 度。可以在试剂盒提供的8种聚合酶及相应反应体系的基础上再添加PCR增剂,以找到PCR适反应体系从而达到佳的PCR反应效果。 为什么选择本试剂盒? 影响PCR反应的因素很多,如聚合酶本身的性质,pH值,酶保护剂,助溶剂等,只有在这些因素都是适的情况下才能获得较好的扩增产物。 |
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
操作流程:
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
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