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Ca2+ GPCR分析-钙离子指示探针Fluo-8,AM
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详细内容
| 中文名称 | 英文名称 | 产品规格 | 货号 |
| Ca2+ GPCR分析-钙离子指示探针Fluo-8,AM | Fluo-8,AM | 2×50μg | GOY-F10174 |
产品说明书:
| Fluo-2早是由Roger Tsien博士发明的钙离子指示剂Fluo系列之一,目,Fluo-3和Fluo-4已成熟商品化。然而,Fluo-2在细胞内比Fluo-4要更明亮,主要可能是由于大部分细胞对Fluo-2的加载能力要高于Fluo-4。 Fluo-3成像涉及到钙离子信号通路的多个方面,Fluo-3经常应用在流式细胞术上,如螯合剂光活化、第二信使、神经递质以及细胞水平的药理筛选。Fluo-3在这些应用里之所以能大量运用主要是由于其几个重要特性:Fluo-3可以被氩离子激光器488nm激发,并在与Ca2+结合后,发射荧光很明亮的荧光信号。Fluo-4是Fluo-3以两个氟原子取代氯原子的类似物,这一微小的结构变化使得Fluo-4探针在488nm激发光下的荧光信号得到增,信号稳定持续,可以应用于共聚焦显微镜、流式细胞仪、微孔板读数仪。 Fluo-2、Fluo-3和Fluo-4在与Ca2+结合后荧光增,与紫外激发的探针fura-2和indo-1不同,不会发生光谱漂移。荧光光密度在与Ca2+结合后,增至少100倍。 加载细胞说明 加载细胞,建议使用膜透性的AM酯类形式的探针,如下操作建议仅供参考。 使用将染料用无水DMSO溶解制成染料的DMSO储液(2~5mM,Fluo-8 MW:1046.93),再用合适培养基稀释一份染料的DMSO储液(2~5mM)到1~10μM的终浓度,加入非离子型去污剂Pluronic F-127可以协助非性的AM酯在水溶液中的扩散。可以简单的通过先等体积混合20%(w/V)的Pluronic与DMSO,确保Pluronic在加载到细胞中的工作浓度是0.02%。 有机阴离子转运抑制剂probenecid(1~2.5mM)或sulfinpyrazone (0.1~0.25mM)可以添加到细胞培养基中,以减少探针在胞脱酯现象。外的Probenecid和sulfinpyrazone储液基本为碱性,因此在添加到培养基中时需要先调整到与所用培养基匹配的pH。 细胞通常可以与AM酯探针在20~37℃条件下孵育20~60分钟,佳的探针加载浓度、时长与温度需要在实验中具体摸索确定。一般来说为了减少可能的毒性负荷,只要满足足够的荧光检测度,选择尽可能低的染料浓度。此外,由于亚细胞结构的分区化特点,AM酯加载技术存在固有的标记问题,这可以通过降低孵育温度来解决。 在进行荧光检测之,细胞应用无指示剂的培养基(允许的话,可以添加阴离子转运抑制剂)充分洗涤,以确保洗去细胞表面的非特异性染料吸附,再另外以新鲜培养基孵育30分钟保证胞内酯酶水解充分进行。这里,可能会有少量的指示剂逸出胞外从而产生背景荧光,可以通过临将上机检测之,在外培养基中添加抗荧光素抗体,来降低背景。 |
低温非冻型保存,不破坏病毒的外壳,方便长途运输。
适用于各种拭子样品,包括口腔拭子、鼻腔拭子、咽喉拭子、阴道拭子等。
可以用于H1N1流感病毒和其他任何可以用拭子取样的病毒。
可以用柱式病毒DNA提取试剂盒或柱式病毒RNA提取试剂盒提取病毒核酸。
试剂本身安全环保无毒。
储存条件:常温,有效期一年。
使用方法:
注意:标本采集人员需按有关规定做好个人防护。咽、鼻拭子好在发病的3天采集。
在安全柜内将本产品分装到自备的、螺旋盖内有橡胶圈的5mL旋盖塑料管里(一容器)。
鼻拭子的采集:将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处,停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入上步得到的、装有3mL本产品的旋盖离心管中,弃去拭子尾部,拧紧螺旋盖。
咽拭子的采集:用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,将棉签浸入步得到的、装有3mL本产品的旋盖离心管中,弃去拭子尾部,拧紧螺旋盖。
直接在一容器上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、患者姓名。
将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封;每袋装一份标本。同时也将标本有关信息填在标本送检表上,连同一容器封于塑料袋内。
将装标本的密封袋放入自备的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料容器(二容器)内,拧紧盖,在容器上标明有关信息。同一患者2份以上的密封标本,可以放在同一个二容器内。二容器要承受不少于95 KPa的压力,内衬具吸水和缓冲能力的物质。所有容器必须印有生物危险标注。
将二容器摆放在用运输箱内(或疫苗运输箱),放入冰排,然后以柔软物质填充,并密封,由人(2人)运送,不得邮寄,好使用车。
采集的标本若不能在24小时内送达,则应尽快在⁻⁷0℃以下保存。无⁻⁷0℃条件的,需在4℃冰箱短时间暂存,并尽快联系递送标本。流感病毒在-20℃~-40℃时不稳定,故长期保存好在⁻⁷0℃温度以下进行。
化铋 99.99% metals basis双(基硅烷基)氨基钠 98%3-(2-氨基乙基)基三乙氧基硅烷(>96.0%(GC))
Ca2+ GPCR分析-钙离子指示探针Fluo-8,AMLuvangetin
操作程序:
注意:重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5—120钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2⁻⁷.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
8.杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗*:37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲苯透明,封片。
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