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细胞内钙离子荧光探针(Fura-2 AM)
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详细内容
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
产品属性:
中文名称:细胞内钙离子荧光探针(Fura-2 AM)
英文名称:Fura-2 pentakis ester
产品规格:50微升
产品货号:GOY-F10143
| 本品是常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。 用于细胞内钙离子检测时,Fura-2 AM的常用浓度为0.5-5μM。通常用含有0.5-5μM的Fura-2 AM的适当溶液和细胞一起在4-37℃孵育15-60分钟,即可完成荧光探针的装载。 本Fura-2 AM(钙离子荧光探针)是配制于无水DMSO(anhydrous DMSO)中的储存液,浓度为2mM。 分子式:C44H47N3O24 分子量:1001.9 Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM的荧光比较弱,大激发波长为369nm,大发射波长为 478nm,并且其荧光不会随钙离子浓度改变而改变。Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2,从而被滞留在细胞内。Fura-2可以和钙离子结合,结合钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较的荧光,而在380nm激发光下则会导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内的钙离子浓度,可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异,荧光探针的渗漏,细胞厚度差异等一些误差因素。Fura-2和钙离子结合后,大激发波长为335nm(大激发波长随离子浓度的的不同而有所不同),大发射波长为505nm。实际检测时推荐使用的激发波长为340nm,发射波长为510nm。如果做双波长检测,则推荐使用的激发波长为340nm和380nm。Fura-2的激发光谱参考下图,不同曲线表示不同钙离子浓度时的激发光谱。 Fura-2相对而言有较的抗荧光淬灭能力,在荧光显微镜或其它荧光检测设备上可以连续检测1小时而不明显影响其荧光效果。 注意事项: 1. 本Fura-2 AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内,可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。 2. 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。 储存条件:-20℃,有效期6个月。 |
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
氧化铜 40nm 球形,99.5%3,4-苯并芘标准溶液 5.25μg/mL,基体:甲4-丁基-4'-羟基查耳酮(>98.0%(HPLC))
细胞内钙离子荧光探针(Fura-2 AM)Stigmastane-3β,5α,6β-triol
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