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钠离子荧光探针
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详细内容
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
产品属性:
中文名称:钠离子荧光探针
英文名称:SBFI, AM
产品规格:1mg
产品货号:GOY-F10170
| Na+敏感型染料,SBFI 和K+敏感型染料,PBFI,是钠钾离子浓度测定时所用到的选择性荧光指示剂。这类苯并呋喃间苯二甲酸酯的衍生物以及其具有膜透性的乙酰氧基甲基酯形式(AM 酯)可以在生理条件(含多种其他一价阳离子)下,给予钠钾离子浓度以上时间及空间上准确的变化测量精度。 此外,这类染料的激光光谱可以选择用与Fura-2 类似的滤光器与检测仪。.这些钠钾探针指示剂由荧光团与氮冠醚成环状连接,赋予各自的配位体选择性。在pH7,且Na 或K 离子缺失的情况下,SBFI 和PBFI 的消光系数大约在42,000 cm-1M-1(346 nm)。一旦与离子结合,其激发峰显著收窄,大激发峰向短波段偏移,光能量吸收比值变为340nm/380nm。SBFI 结合Na 离子之后荧光度约增2.5 倍,但发射光谱大值基本不变。pH6.5~7.5,这类荧光素的光谱特性基本维持不变,相比较而言,离子浓度和粘度对其影响更大。 虽然这类离子指示剂有相当的选择性,但对于Na 离子亲和的SBFI 来说K 离子同样有一定的影响,PBFI 也是如此。在K 离子生理浓度下,SBFI 对于Na 的Kd 值为11.3mM,而没有K 离子存在时,则为3.8mM。SBFI 对Na 的选择性比K 要高出18 倍。 同样地,PBFI 对K 离子的解离常数也烈地依赖于Na 的存在。Na 的是否存在,使得PBFI 对于K 离子的Kd 从100mM 到10mM不等。虽然PBFI 对于K 离子的选择性仅仅高出Na 的1.5 倍,但在细胞的生理条件下,通常K 离子的浓度要高于Na 的10 倍以上。所以,在胞内加载探针时,这些探针的Kd 值应与适当的载体做校准。 用无水DMSO 制备SBFI 酯类的储液,浓度为10mM。SBFI AM 的相对分子量分别为1127.由于这类AM 酯形式的探针水溶性比较差,建议溶解时,使用必要的Pluronic F-127.通常可以在进行加载探针到细胞之,将探针的DMSO 溶液与等体积25%(w/V)的PluronicF-127 混合。探针加载浓度范围:5μM~10μM,孵育时间40 分钟~4 小时。具体的加载条件好能参考相关文献或者实验摸索,因为该探针在不同的细胞内的Kd 值不同。校准细胞内SBFI 的Kd 可以用短抗生素。一般来说,这些指示探针可以用340nm 激发光激发,但在380nm 荧光对于目的离子的浓度尤其敏感。发射峰的检测可以设置在500nm,计算Na+浓度。 |
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
羟基纤维素 II型,粘度:100000mPa.s Standard for GC2,2'-二氨基-4,4'-双噻唑(>98.0%(HPLC)(T))
钠离子荧光探针Columbianadin
注意事项:
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
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