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血清血浆尿液游离RNA提取试剂
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详细内容
中文名称:血清血浆尿液游离RNA提取试剂
英文名称:RNAtiqu Circulating RNA Extraction Reagent
产品规格:50ml
产品货号:GOY-F9523
| 本品特别适用于从血清、血浆中分离纯化包括microRNA和其他小RNA(<200nt)在内的总RNA。本品灵活处理不同起始量的样品,在有效裂解样本的同时,可有效保存RNA的完整性,提取的总RNA完整性好,无蛋白和DNA污染,提取的RNA可用于RT-PCR、Northern Blot和分子克隆等下游实验。 自备试剂:、异丙醇、75%乙醇、无RNase的水(新开封或提取RNA用)。 实验准备及重要注意事项: 1、预防RNase污染,应注意以下几方面: ① 使用无RNase的塑料制品和枪头,避免交叉污染。 ② 玻璃器皿应在使用于180℃高温下干烤4小时,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底冲洗后高压灭菌。 ③ 配制溶液应使用无RNase的水。 ④ 操作人员戴一次性口罩和手套,实验过程中要勤换手套。 2、提取的样品避免反复冻融,否则影响RNA提取得率和质量。 3、本品中含有,具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品,如装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到眼睛,应立即用大量的水冲洗并往医院治疗。 4、样品用游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂匀浆后,如不即刻加入,置于⁻⁷0℃可放置一个月以上。 5、保存在75%乙醇中的RNA沉淀,2~8℃可以保存一周,-20℃条件下可以保存1年。RNA半衰期比较短,容易降解,建议提取后尽快进行后续实验,如反转录成cDNA,Northern Blot等。 6、若下游实验对DNA非常敏感,建议用不含RNase的DNase I对RNA进行处理。 操作步骤: 1、取200μl新鲜或者冻存的血清或血浆,加入3倍体积的游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂。振荡30,充分混匀。 注意:样本加入游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂后,可能会出现沉淀,经过振荡混匀后,沉淀基本消失。若仍有少量沉淀,不影响下游实验,可继续操作。 2、将处理后的样品在室温放置5分钟,使蛋白核酸复合物完全分离。 3、向以上溶液中加入,每使用1ml血清/血浆样本用总RNA提取试剂加入0.2ml,盖好管盖,剧烈振荡15,室温放置2-3分钟。 注意:如不能涡旋混匀,可手动快速颠倒混匀2分钟。 4、4℃ 12000rpm离心20分钟,此时样品分成三层:红色有机相,中间层和上层无色水相,RNA 主要在水相中,把水相转移到一个新的无RNase的离心管(自备)中。 5、在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置30分钟。或-20℃沉淀过夜,效果更佳。 6、4℃ 12000rpm 离心20分钟,弃上清。 注意:离心RNA沉淀经常是看不见的,离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。 7、加入75%乙醇(用无RNase的水配制)洗涤沉淀。每使用1ml游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂加入1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。 8、4℃ 12000rpm离心3分钟,小心吸弃上清,注意不要吸弃RNA沉淀。 注意:剩余的少量液体可短暂离心,然后用枪头吸出,注意不要吸弃沉淀。 9、室温放置2-3分钟,晾干。加入30-100μl无RNase的水,充分溶解RNA,得到的RNA保存在⁻⁷0℃,防止降解。 注意:沉淀不要过分干燥,以免难于溶解。 储存条件:2~8℃。 |
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。*消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会
影响细胞膜上磷脂酰*与Annexin V-FITC的结合。消化时将*铺满孔板底后,轻摇时*与细胞充分接触,然后倒掉大部分*,利用剩余的少量*再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。
1.CTAB 溶液在低于15℃时会析出沉淀,因此在将其加入冷冻的植物材料中之必须预热。
2.在适条件下,DNA—CTAB 沉淀呈白色纤维状,很容易一下子就从溶液中钩出。不过,某些植物种的DNA 沉淀中可能含有杂质,特别是多糖,使DNA 沉淀呈絮状或胶状,这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA. —CTAB 沉淀。
3.饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA 酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用*和的混合液,可减轻这两种现象,同时可加入适量的异戊醇(*—异戊醇=25:24:1),异戊醇的作用是消泡,并使蛋白质层紧密,使水相和有机相分层较好。 细菌的培养和收集 将含有质粒pBS 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。
操作流程:
1.根据要保存的各样本的体积,计算出所需RNAwait用量。RNAwait的用量应当是组织体积的10倍(如100mg组织约用1ml RNAwait);离心收集2×106细胞RNAwait的用量是1ml。
2. 将RNAwait按需要量分装入自备保存管中;
3. 快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状,立即完全浸入RNAwait中。组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则RNAwait不能有效渗入,组织中间部位的RNA不能受到保护。较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏,小鼠的大部分器官)取下后可以直接浸入RNAwait。
4. 保存时先将样本浸入RNAwait后置4℃冰箱过夜(4℃过夜是必需的,这样可使RNAwait完全渗入到组织中),然后转移到-20℃冰箱(RNAwait在-20℃时仍为液态,有结晶析出,是正常情况);或者在4℃冰箱过夜后,从RNAwait中取出组织块,转移到-80℃冰箱。在RNAwait中保存的标本,反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。
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血清血浆尿液游离RNA提取试剂Tofacitinib citrate
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