样本前处理有哪些注意事项？

首先要区分目标物的理化特性，前处理步骤不能造成待测抗原降解、沉淀或者损失。如果目标蛋白对蛋白酶敏感，提取或者稀释阶段就要及时添加蛋白酶抑制剂，同时全程控制低温操作，避免常温长时间放置；有些小分子、多肽容易被有机溶剂破坏，脱脂、沉淀时溶剂种类、作用时间和比例需要严格控制，不能盲目加大试剂用量。前处理方案选定前做加标回收验证，确认目标物不会随着杂质被去除步骤一起丢失。

其次要根据干扰物类型选择对应的处理方式，避免处理手段错配。脂蛋白脂血样本采用高速离心脱脂，优先低温离心，尽量避免有机溶剂脱脂，有机溶剂容易带走疏水型目标物；组织匀浆样本如果核酸过多造成黏度大、吸附干扰，可以加入核酸酶，但是要确认核酸酶本身不会对后续免疫反应产生影响；溶血严重的样本尽量直接舍弃，轻度溶血样本离心去除红细胞碎片，血红蛋白很难通过简单前处理完全清除。蛋白沉淀法去除杂蛋白时，沉淀条件需要摸索，沉淀剂除了沉淀杂蛋白，也有可能共沉淀目标抗原。

操作过程中要保证处理条件统一，所有样本、基质对照、加标样本同步进行前处理，离心转速、温度、时间，试剂添加顺序、反应孵育时长保持一致，不然引入新的系统偏差。离心后吸取上清的时候，避开下层沉淀、表层浮油，脂血样本吸取中间层上清，不要吸到油脂层，否则前处理失去效果。

需要设置配套对照来评估前处理的影响，单独设置经过相同前处理的加标样本组，和不做前处理的同浓度加标组对比信号与回收率，用来判断前处理本身会不会带来目标物损失。同时设置基质空白，用来观察前处理试剂本身会不会引入新的背景干扰，部分沉淀试剂、酶制剂自身蛋白也会吸附到板上抬高空白。

注意 pH 和离子强度的变化，很多前处理试剂会改变溶液酸碱环境和盐浓度，处理完成之后置换或者回调到和 ELISA 样本稀释液接近的缓冲体系。如果上清液 pH、盐浓度偏差过大，进入反应体系后会改变蛋白带电状态，加重板面吸附干扰或者抑制抗原抗体结合，造成结果误判。

控制前处理带来的稀释效应，脱脂、沉淀、透析等操作很多时候会伴随体积变化，计算最终浓度的时候必须计入稀释倍数，不校正稀释倍数会直接导致浓度计算偏低。如果处理后需要浓缩，浓缩步骤也要验证目标物有没有吸附在滤膜、离心管管壁上造成损失。

还要关注污染和稳定性风险，前处理步骤越多，引入微生物污染、交叉污染的概率越高，耗材尽量无菌无酶，移液更换枪头。处理完成的样本尽快上板检测，不能马上检测的，分装后按照验证好的条件保存，避免反复冻融。

分清前处理的边界，前处理是用来降低基质干扰，无法消除所有类型干扰。蛋白脱脂、去杂蛋白主要改善板面竞争吸附类基质效应，对异嗜性抗体这类免疫干扰基本无效，这类干扰不能依靠前处理解决，需要搭配阻断剂等其他方案。如果前处理之后回收率明显下降，说明该处理方式不适用于这个体系，需要更换别的手段。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司