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“上海恒远”文献：Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ１通过ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ途径介导对醋酸铅所致神经元凋亡的保护作用

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上传时间：2019/7/26 10:11:23

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“上海恒远”文献：Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ１通过ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ途径介导对醋酸铅所致神经元凋亡的保护作用
崔卫刚１，张应花１，任铭新１，路德荣２，杨彩玲３
（１．新乡医学院人体解剖学教研室，河南新乡４５３００３；２．新乡医学院第三附属医院消化内科，河南新乡４５３００３；３．新乡医学院第一附属医院口腔外科，河南新乡４５３１００）

［摘要］目的：通过制备铅中毒模型诱导原代培养神经元凋亡来探讨ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ１（ＮＲＧ１）的抗神经元凋亡作用及机制。方法：将ＮＲＧ１和（或）ＰＩ３Ｋ抑制剂Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）加入到原代培养神经元的培养基中进行预孵育４ｈ，然后用醋酸铅刺激原代神经元４ｈ，观察ＮＲＧ１的抗凋亡作用及机制。用Ｃａｓｐａｓｅ３活力变化来检测神经元内凋亡的表达水平，同时，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＮＲＧ１β１和ｐ－Ａｋｔ的水平。结果：在用铅刺激原代神经元后，细胞凋亡明显，表现为Ｃａｓｐａｓｅ－３活力显著增加（Ｐ＜０．０５）。ＮＲＧ１能抑制铅染毒引起的Ｃａｓｐａｓｅ－３活力增加（Ｐ＜０.０５）。ＮＲＧ１可上调ｐ－Ａｋｔ的表达，应用ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ的抑制剂Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ后，Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ能拮抗ＮＲＧ１的升高ｐ－Ａｋｔ及抗凋亡作用（Ｐ＜０．０５）。结论：ＮＲＧ１显著抵抗铅诱导的神经元凋亡，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ途径参与介导ＮＲＧ１的抗神经元凋亡作用。

关键词］神经调节素１；凋亡；铅；ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路醋酸铅是一种常见的重金属毒物，对人体多种器官，尤其是神经系统的损害更为明显［１］。铅中毒能影响脑及肝内的丙二醛的水平，同时还能损伤一氧化氮合酶及超氧化物歧化酶的活力［２］。神经调节素１（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ１，ＮＲＧ１）是一种上皮生长因子，来源于血管内皮，能激动酪氨酸激酶受体家族ＥｒｂＢ４。近年来，ＮＲＧ１／ＥｒｂＢ４信号对神经细胞的生长、发育和凋亡的影响受到广泛关注［３－４］。细胞凋亡途径在铅中毒性脑病中起着关键作用，而ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ是重要的细胞凋亡通路。有研究显示，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路的活化能抑制细胞凋亡［５］。然而，ＮＲＧ１对铅诱导的神经元凋亡过程及机制尚不明确。为此，我们利用铅诱导培养的神经元凋亡模型，观察ＮＲＧ１的抗凋亡作用及机制。

１材料方法
１．１细胞培养的实验步骤取新生小鼠，显微解剖镜下，小心取出全脑，Ｄ－ｈａｎｋｓ液洗数次，并剥除软脑膜及血管，分离出皮层，剪碎。用０．２５％的胰酶，３７ ℃消化２０ｍｉｎ，并机械吹打成为单细胞悬液，１０％胎牛血清终止消化，离心倾去上清液，培养基重悬细胞，台盼蓝染色快速计数，调整细胞终密度为（１～５）×１０５个／ｍｌ，接种于涂多聚赖氨酸的培养板内。于３７ ℃、５％ＣＯ２培养箱内培养，每３天用培养基按１／３～１／２量换液。

１．２试剂醋酸铅（ｌｅａｄａｃｅｔａｔｅ，ＰｂＡＣ，上海恒远试剂公司，６０８０－５６－４，纯度：９９．５％）；兔抗人ＮＲＧ１多克隆抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司）；兔抗人ｐ－Ａｋｔ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ公司）；重组人ＮＲＧ１（Ｒ＆Ｄ公司，ｎｏ．３７７－ＨＢ／ＣＦ，９８％）；ＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｎｃａｃｉｄ，ＢＣＡ）试剂盒（碧云天公司，Ｐ０００９）。

１．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测将处理好的细胞离心，蛋白裂解液裂解并匀浆。于４ ℃ １２０００×ｇ，离心３０ｍｉｎ。抽取上清液备用，ＢＣＡ方法测定蛋白含量，分装。蛋白上样量２０μｇ，５％浓缩胶及１０％分离胶电泳，电转到ＰＶＤＦ膜，脱脂牛奶封闭，加兔抗人ＮＲＧ１抗体（１∶２０００，ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司）、兔抗人ｐ－Ａｋｔ抗体（１∶２０００，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ公司），４ ℃ 过夜。ＴＢＳＴ（ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ－ｓａｌｉｎｅｗｉｔｈｔｗｅｅｎ，ＴＢＳＴ）进行漂洗１０ｍｉｎ×３次，加入辣根过氧化物酶标记二抗（１∶２０００，ＫＰＬ公司），室温２ｈ，ＴＢＳＴ漂洗１０ｍｉｎ×３次。发光，显影、定影、用β－ａｃｔｉｎ为内参
（１∶２０００，ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司），成像分析仪扫描，目的蛋白和内参灰度值的比值，作为待测蛋白表达相对水平。

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