基质加标回收结合梯度稀释法的注意事项有哪些？

首先要确认基质本身的本底情况，优先选用不含待测目标物的阴性基质开展试验。如果基质里面内源含有目标物，就不能直接套用常规加标计算方式，必须单独设置基质空白孔，后续基质组所有数值都要扣除基质本底；完全找不到阴性基质的时候，不能继续使用这个梯度加标方案，需要更换标准加入法，避免结果误判。

抗原母液要统一，缓冲液梯度系列和基质梯度系列必须来自同一支母液，保证理论加标浓度完全对等，不能分开配制母液。稀释操作的方式、稀释倍数、移液体积、稀释顺序保持一致，尽量同步稀释，减少抗原放置时间差异带来的降解误差，逐级稀释的时候要充分混匀，避免浓度不均。

板内排布需要规避系统误差，缓冲液组和基质组的浓度孔交叉排布，不要整块板一侧全部是缓冲组、另一侧全部是基质组，降低孵育位置差异、边缘效应带来的影响。外圈孔建议设置保护孔，只加稀释液，不放置样本和标准品。如果同时对比高结合力与中结合力板条，两个板条体系要分开独立实验，不能混在同一块板上。

整套实验的所有条件必须严格保持统一，包被、封闭、孵育温度和时长、洗板次数、浸泡时间、拍板力度、显色时间、终止时机都不能有差别，同一批次配洗涤液、封闭液、抗体工作液、显色液，同一台酶标仪、同一波长参数读板。显色环节尤其重要，基质组和缓冲组要同时终止，防止显色动力学差异掩盖真实基质干扰。

梯度范围设计要覆盖线性区间和饱和平台区，只设置在线性区间的浓度点无法判断是否存在板面吸附竞争，饱和平台是区分吸附干扰和免疫干扰的关键。梯度点数正式验证不少于六个，包含空白点、低浓度、中浓度、高浓度以及达到平台的高点，每个浓度设置两个及以上复孔，方便计算复孔变异。

要区分不同类型的干扰信号，不能简单依靠回收率高低下结论。饱和平台下降提示基质组分竞争板面吸附位点；平台一致、仅基线抬高，多为非特异吸附背景升高；平台高度相近但曲线不平行、斜率差异明显，属于免疫识别层面的抑制，不是固相吸附干扰。同时单独设置未经过抗原孵育的基质空白孔，用来识别溶血、脂血、色素、浊度这类光学读数干扰，这类干扰不属于吸附或者免疫干扰。

稀释带来的基质效应衰减需要留意，基质干扰大多会随着稀释倍数升高逐步减弱，低稀释倍数下回收率偏差大、高稀释倍数回收率回归正常，是基质干扰很典型的特征，分析结果的时候不能只看单一稀释点。移液过程注意避免交叉污染，加样顺序规范，更换枪头，高浓度孔不要往低浓度孔方向加样。

还要关注基质本身理化性质带来的次生影响，基质加入之后有可能改变体系 pH、离子强度，间接改变蛋白带电状态和吸附能力，试验过程中可以同步监测混合后的 pH，pH 发生明显偏移时，要区分是基质本身带来的理化影响，还是组分竞争吸附。另外基质里的蛋白酶会降解抗原或者抗体，基质样本如果没有添加合适的蛋白酶抑制剂，储存和孵育阶段发生降解，会造成信号偏低，被误判为基质吸附干扰。

是结果判定边界，回收率仅在线性区间内用来评估基质效应，饱和平台点不适合计算回收率。自建体系回收率接受区间可以根据项目需求设定，常规一般控制在百分之八十到百分之一百二十，同时要结合曲线平行性一起判断，不能只依靠回收率一个指标。如果平行性很差，哪怕单点回收率落在合格区间，也代表基质存在免疫干扰，方法不适用。

原创作者：上海笃玛生物科技有限公司