紫外分光光度法

注意：正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号：CT-C-A906

规格：50T/48S

产品内容：

试剂一：液体100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体5mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存，临用加入 40mL试剂一；

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存，临用加入 2.5mL试剂二；

标准品：液体0.5mL×1 支，4℃保存。10μmol/mL谷氨酸标准品。

产品说明：

Glu广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，不仅是组成蛋白质的20 种氨基酸之一，而且通过转氨基作用参与多种氨基酸合成，是生物体内主要氨基来源之一。此外，Glu还是味精的主要有效成分，常用做食品添加剂以及香料生产。

谷氨酸脱氢酶 (GDH) 催化谷氨酸和 NAD生成α-酮戊二酸、NADH和NH4+ ，引起340nm处吸光度的上升，通过测定340nm吸光度的变化，计算谷氨酸含量。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、谷氨酸提取

细菌、细胞或组织样品：收集细胞或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500 万细菌或细胞加入1mL试剂一，超声波破碎细菌或细胞 (功率 20％，超声3s ，间隔10s，重复30 次)，10000rpm ，常温离心10min ，取上清待测。

称取约0. 1g组织，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆，10000 rpm，常温离心10min，取上清待测。

二、测定步骤

1 、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、标准溶液的制备

将标准品分别稀释为2.5 、1.25 、0.625 、0.313 、0. 156 、0.078 、0.039μmol/mL 的标准溶液。

3、在1 mL石英比色皿中加入下列试剂：

a.标准管：在1 mL石英比色皿中加入200μL标准溶液、800μL试剂三和50μL试剂四混匀，立即记录340nm 处20s 时的吸光值为A1 和5min20s 时的吸光值A2 ，计算∆A=A2-A1。

b.测定管：在1 mL石英比色皿中加入200μL样本、800μL试剂三和50μL试剂四混匀，立即记录340nm处20s 时的吸光值为A1 和5min20s 时的吸光值A2 ，计算∆A=A2-A1。

三、谷氨酸含量计算

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1、标准曲线的绘制：

以谷氨酸含量 (µmol/mL) 为 x轴，标准管∆A为y轴，绘制标准曲线y=kx+b。将测定管∆A带入方程得到x 值。

2 、氨基酸含量计算：

(1) 按照蛋白浓度计算

谷氨酸含量 (µmol/mgprot) =x×V样本÷ (Cpr×V样本) =x÷Cpr。

(2) 按照样本鲜重计算

谷氨酸含量 (µmol/g鲜重) =x×V样本÷ (W÷V样总×V样本) =x÷W。

(3) 按照细菌或细胞数量计算

谷氨酸含量 (μmol/104 cell) ＝x×V样本÷ (500÷V样总×V样本) =0.002x。

V 样总：加入提取液体积，1mL；V 样本：加入的样本体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；1000：细菌或细胞总数，1000 万。

注意事项：

为提高检测灵敏度，测定管的吸光值应小于1 且∆A小于0.4 ，若大于此值则需要将上清液用试剂一稀释至适当倍数后测定。