用乙酰化抗体填料及HRP标记乙酰化抗体快速检测和定量细胞总乙酰化蛋白

一、IP-ELISA联合方法原理及流程：

方法原理及流程说明：

1）从实验组和对照组的细胞中分别取400ug粗蛋白，每组用10微升抗乙酰化抗体琼脂糖填料(ICP0388)富集（IP）。

2）结合于琼脂糖填料上的乙酰化蛋白每次用100uL 0.1 mol/L HCl，洗脱两次。

3）将洗脱液汇集在一起，用饱和碳酸钠调节pH值至中性。

4）然后取洗脱液100uL/孔包被于酶标板上，重复包被两孔，在室温下培养过夜。

5）第二天用PBSt清洗板孔2次，用0.1%BSA inPBSt封闭板孔，孵育30分钟，再用PBSt洗涤三次。

5）在37℃下添加HRP标记的抗乙酰化抗体（ICP0381）用0.1%BSA in PBSt稀释到0.25 ug/Ml,孵育30分钟。

6）用PBSt清洗板孔4次，每孔加100uL TMB，培养30分钟显色。

7）每孔10 uL 2 mol/L 硫酸终止显色。在450 nm处读取吸光度（OD）。

8）通过OD（处理）/OD（未处理）计算反应性乙酰化蛋白水平。

实例1：分析用不同浓度的TSA处理12小时的细胞中的总乙酰化蛋白水平。即先用抗AcK琼脂糖填料（ICP038）富集IP,再以ELISA方法用HRP标记的抗乙酰化抗体（ICP0381）做检测不同浓度TSA处理的细胞中，快速检测出其蛋白质乙酰化增加达10倍。

二、IP-WB联合方法高确定性检测乙酰化蛋白

实例2：分别用HDAC抑制剂TSA处理5和15小时后，对MMRU细胞样品中的乙酰化蛋白质进行Western blot分析。即样品先用抗乙酰化赖氨酸琼脂糖填料（ICP0388）亲和富集（IP），再用WB方法，加入HRP标记的抗乙酰化抗体（ICP0381）进行检测，快速得到高确定性的WB结果。

三、快速检测乙酰化蛋白所用到的相关抗体试剂

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