冻存 HeLa S3 细胞
70% 乙醇 wan全 MEM-10 胰酶／EDTA
旋转瓶wan全培养基-5 25 cm2 组织培养瓶 C02 培养箱 Sorvall H-6000A 转子 100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶和带滤膜的瓶盖

步骤

1. 将含有冻存 HeLa S3 细胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解冻。

2. 用 70% 乙醇对安瓿的顶端进行消毒，打开安瓿，用吸管将细胞转移到含有 5 mlwan全 MEM-10 培养基的 25 cm2 组织培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，放入 5% CO2 加湿培养箱中 37℃ 培养过夜。

3. 将培养基吸出，用 0.5 ml 37℃ 的胰酶/EDTA 覆盖细胞，消化 30～40 s。

4. 加入 10 ml 旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞转移至 50 ml 的离心管中。室温 1800 g 离心 5 min，弃上清。

5. 将细胞沉淀悬浮在 5 ml 的旋转瓶wan全培养基-5 中，上下吹打，将细胞团打散。

6. 在 100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶中加入 50 ml 旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞悬液转移到瓶中。

7. 取出 1 ml 细胞悬液，用血细胞计数器（附录 3F) 进行细胞计数。加入适量的旋转瓶wan全培养基-5，使细胞密度为（3～4）× 105 细胞/ml。将细胞放入无 CO2 培养箱，37℃ 旋转培养。

8. 随后的两天让细胞继续生长，并且每天对细胞进行计数，加入适量的旋转瓶wan全培养基-5 以维持（3～4）×105 细胞/ml 的细胞密度。

9. 取 1 ml 的细胞悬液，用血细胞计数器对细胞进行监测。

10. 当细胞密度达到（4～5）×105 细胞/ml 时，隔天或每天用培养基将细胞稀释至 1.5×105 或 2.5×105 细胞/ml。

11. 分别将装有 50 ml 或 100 ml 细胞悬液的 100 ml 或 200 ml 通气旋转瓶放入 37℃ 无 CO2 培养箱旋转培养。每天或隔天传代。

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