厚切片荧光成像与去模糊技术方案

在神经生物学、发育生物学、肿瘤与类器官研究中，研究者越来越多地需要观察“厚样品”：几十到几百微米厚的脑片、组织切片、类器官与透明化整装样本。这类样品带来了一个共同的成像难题——离焦模糊。厚度越大，来自焦点以外平面的荧光信号就越强，它们叠加在焦平面图像上，让画面发灰、发糊、对比度下降，细微结构（神经突起、细胞突起、亚细胞定位）被淹没在这层“背景光”之中。传统上解决这一问题的办法是共聚焦或双光子等点扫描技术，用物理针孔“挡掉”离焦光，但它们扫描速度较慢、光毒性较高、成本也更高。徕卡Leica THUNDER系列成像系统提供了另一条路径：用计算的方式在宽场成像中去除离焦模糊，在保持高速与高灵敏度的同时，得到接近共聚焦的清晰度。广州九尾狐光电作为多品牌显微镜设备经销商与服务商，可为高校、科研院所与企业研发中心供应徕卡THUNDER等成像系统，并配套选型、成像方案落地与售后支持。

注：厚组织样品的荧光成像：在厚样品中，来自焦平面以外的离焦信号会叠加在焦平面图像上，导致背景升高、对比度下降；去除离焦模糊是获得清晰厚样品图像的关键。

一、行业背景：厚样品荧光成像的两难

荧光显微成像在“薄样品”（如单层培养细胞）上表现：样品只有一层，几乎没有离焦光，宽场显微镜就能得到高对比度的图像。但当样品变厚，问题立刻显现。以100微米厚的脑片为例，焦平面上下的荧光都会进入物镜，形成一层“雾”。要让纵深方向的结构清晰，就必须进行光学切片（optical sectioning）。

实现光学切片的经典方案有三类：激光扫描共聚焦（CLSM）、转盘共聚焦（spinning disk）、双光子（2P）。它们的共同思路是用针孔或非线性激发“物理地”排除离焦光，效果好，但代价是：扫描点逐点成像，速度受限；激发光在厚样品中反复照射，光漂白与光毒性累积；系统复杂、成本高，对活体与长时间观察不够友好。因此，研究者一直希望有一种既“快、温柔、便宜”，又能实现光学切片效果的方法——这正是计算成像（computational imaging）要解决的问题。

二、THUNDER的核心：用计算去除离焦模糊

THUNDER系列的基本思路，是在宽场成像的基础上，用算法即时去除离焦模糊，而无需针孔或点扫描。它包含两层关键能力：

即时计算清除（Instant Computational Clearing）：在采集的同时，对每一帧图像实时执行离焦信号的估计与去除，得到“即时清晰”的预览画面。研究者无需等待后处理，就能看到接近光学切片效果的图像。

结合自适应解卷积（deconvolution）：在计算清除的基础上，进一步进行自适应解卷积处理，提升分辨率与对比度，尤其适合需要精细结构的厚样品图像。

这两层处理的价值在于：一是保持宽场成像的高速度与高灵敏度，对活体、动态过程更友好；二是对样品“温柔”，激发光剂量远低于点扫描；三是覆盖厚样品——从几十微米的组织切片，到几百微米的类器官与透明化样本，都能获得显著改善的清晰度。

三、厚切片荧光去模糊的实现要点

把“去模糊”真正用于厚切片，需要软硬件协同。THUNDER平台在以下环节支持这程：

高速、高灵敏的成像前端：配合sCMOS相机与高数值孔径物镜，在低光剂量下获得高信噪比的原始图像，为后续计算处理提供良好输入。

实时处理管线（THUNDER Live）：在活体、动态、长时间成像中同步进行去离焦处理，让研究者“边看边得到清晰结果”，适用于需要即时反馈的实验。

厚样品工作距离与照明：针对厚切片与整装样本，配合长工作距离物镜与合适的荧光照明，保证深层信号的有效采集。

原始数据可留存：平台保留原始未处理数据，并对处理过程可追溯，满足科研结果可复核、可验证的要求。

四、典型应用场景

THUNDER的去模糊能力，在多种厚样品研究中兑现价值：

神经组织：脑片、脊髓切片中的神经元形态、树突棘与神经投射，去除离焦后突触层结构更清晰，便于在三维中追踪神经突起。

注：厚组织三维荧光成像的另一示例：对厚样品进行三维成像，可在纵深方向上分辨细胞与荧光标记的空间分布，为研究组织内部结构提供依据。

类器官与球状体：脑类器官、肿瘤球体内部的分层结构、细胞分布与标志物表达，需要在较厚样品中做三维观察，去模糊能显著改善深层清晰度。

注：透明化类器官中胶质细胞的三维成像：对经透明化处理的类器官进行GFAP等标记的荧光成像与三维重建，可观察胶质细胞在类器官中的分布，是厚样品三维观察的代表性场景。

组织切片与骨组织：免疫荧光标记的组织切片、骨活检样本等，在较厚条件下观察细胞与蛋白表达的空间关系，去模糊有助于在保持标记对比度的同时呈现三维分布。

注：骨组织活检切片的共聚焦免疫荧光：对骨组织中的骨细胞及标记蛋白进行成像，可在组织深度方向观察信号的空间分布，是厚组织切片荧光观察的典型对象。

五、选型与落地建议

面向厚切片荧光成像的系统规划，可从以下方面考虑：

样品类型与厚度：明确主要观察对象的厚度范围（组织切片/类器官/透明化样本），据此选择物镜的工作距离与数值孔径组合。

速度与活性需求：对活体、动态、长时间成像，优先考虑具备实时去离焦处理能力的配置；对固定样品，可侧重于分辨率与对比度的优化。

数据处理与留存：确认原始数据留存与处理参数记录能力，保证结果可复核、可写入论文方法部分。

与既有流程的衔接：评估与现有样品制备（免疫荧光、透明化）、三维重建与定量分析流程的兼容性。

总体而言，徕卡THUNDER以“宽场速度+计算去模糊”的路线，为厚切片荧光成像提供了一条兼顾清晰度、速度与光温和性的技术路径。它把原本依赖共聚焦才能得到的光学切片效果，以更快的速度、更低的成本和对样品更友好的方式带到宽场成像中，是厚样品荧光研究值得考虑的成像平台。