除了竞争ELISA和表面等离子共振，还有哪些方法可以评估抗体的亲和力？

生物层干涉 BLI，是最常用的 SPR 替代方案，同样属于表面固定、无标记、实时动力学检测，传感器探头浸入微孔样品，通过干涉信号读出结合与解离，也能得到 ka、kd 和 KD。它通量更高、操作更简单，粗样品耐受度更好，适合大量抗体初筛；缺点同样是存在固定带来的表面效应，超高亲和力的解离速率很难准确测定PMC。

微量热泳动 MST，是均相溶液体系，不需要固定分子。分子结合之后大小、电荷、水化层改变，在温度梯度里迁移行为随之变化，以此拟合 KD。样品消耗很少，还可以在裂解液、血清这类复杂基质里测试，小分子半抗原也适配；多数情况需要荧光标记，一般不容易拿到完整动力学速率，只得到平衡亲和力PMC。

等温滴定量热 ITC，依靠捕捉结合释放或者吸收的热量，无标记、无需固定，一次实验同时给出 KD、结合计量比、焓变与熵变，适合研究结合驱动力。它是热力学层面的手段，样品消耗偏大、通量低，不适合大批量筛选，更适合对少数候选抗体做深度表征。

动力学排斥分析 KinExA，也是溶液平衡法，被认为特别适合亚纳摩尔级别的高亲和力抗体。先让抗体和游离抗原在溶液充分平衡，再快速流过包被抗原的微球，捕获体系里剩下的游离抗体，避免结合复合物在检测过程解离。它避开固相固定的假象，测出来的亲和力更接近真实溶液状态，但通量偏低，操作流程较长PMC。

平衡透析属于经典老牌方法，依靠半透膜隔开游离抗原与抗体，平衡之后测定膜两侧游离抗原浓度，计算结合比例，尤其适合小分子半抗原。设备简单，不需要贵重仪器；缺点是耗时久，样品消耗大，容易受非特异吸附、膜吸附影响，现在更多用于方法比对，不再作为。

荧光类方法包含荧光淬灭与荧光偏振。荧光淬灭利用抗体色氨酸内源荧光，或者标记抗原的荧光在结合之后发生淬灭，通过梯度配体得到结合曲线；荧光偏振则是标记小分子抗原，结合抗体之后转动变慢，偏振信号上升，非常适配竞争 ELISA 配套的半抗原体系。它们成本低、均相快速，但是容易受杂质、自发荧光干扰，更适合相对定量与初筛。

流式细胞亲和力测定，针对膜抗原。把荧光标记抗体和表达靶抗原的活细胞孵育，设置梯度抗体浓度，扣除阴性细胞本底，用饱和结合曲线拟合 KD。优势是抗原保持天然膜上构象，适合靶向膜蛋白的抗体；要留意区分亲和力和亲合力，多价结合很容易高估结果PMC。

质量光度法 MP，属于单分子无标记手段，直接统计溶液里游离分子与复合物的分子质量分布，算出结合比例与 KD，样品用量极低，还可以同时判断聚集与计量比。对样品纯度有一定要求，更适合中小规模候选验证PMC。

另外还有放射配体 Scatchard 分析，早年常用，依靠放射性标记抗原，做饱和结合并绘制 Scatchard 图求解 KD，准确度不错，但是放射性管控麻烦，现在已经很少使用。

简单区分，如果想要动力学、高通量初筛优先选 BLI；样品珍贵、基质复杂选 MST；想要热力学全套数据选 ITC；目标是超高亲和力、希望避开固相假象就选用 KinExA；如果只是配套半抗原体系做低成本初筛，荧光偏振会很合适。