NADH氧化酶（NOX）活性检测试剂盒（微量法）

注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

产品货号：BA1239

产品规格：100管/48样

产品简介：

NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生，而且与免疫反应密切相关。

NOX能够将NADH氧化为NAD，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。

产品内容：

试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体1mL×1瓶，-20℃保存。

试剂四：液体35mL×1瓶，4℃保存。

试剂五：液体5mL×1瓶，4℃保存。

试剂六：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入4.5mL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样品测定的准备：

1、组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

2、准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

3、将匀浆600g，4℃离心5min。

4、将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

5、将上清液转移至另一EP管中，用于线粒体中泄露NOX活性测定。

6、沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL试剂三，用于NOX活性测定。

7、NOX总酶活即为上清中NOX活性与沉淀中NOX活性之和。

二、测定步骤和加样表：

1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上；

2、试剂四37℃保温放置。

将上述试剂按顺序在微量玻璃比色皿/96孔板中操作，加入试剂六后立即混匀，同时开始计时，在600nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃水浴中，准确反应1分钟。迅速取出比色皿并擦干，记录1分20秒时的吸光度A2。计算ΔA=A1-A2，记录A测定、A对照，ΔA1=ΔA清测定-ΔA上清对照，ΔA2=ΔA沉淀测定-ΔA沉淀对照。96孔板放于就近的恒温箱中，有些酶标仪带有内控温度设置的请设置为37℃，1分钟后再次测量即可。

三、NOX活力单位的计算：

（一）用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下

A、上清中NOX活力的计算:

1、组织中NOX活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA1÷0.01×V反总÷(Cpr上清×V样本)=2500×ΔA1÷Cpr上清

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g鲜重）=ΔA1÷0.01×V反总÷(W÷V提取×V样本)=2525×ΔA1÷W

2、细菌或培养细胞中NOX活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA1÷0.01×V反总÷(Cpr上清×V样本)=2500×ΔA1÷Cpr上清

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/10⁴cell）=ΔA1÷0.01×V反总÷(500÷V提取×V样本)=5.05×ΔA1

V反总：反应总体积，0.25mL；V样本：加入样本体积，0.01mL；V提取：加入提取液体积，1.01mL；Cpr上清：上清中蛋白浓度，mg/mL；W，样本鲜重，g；500，细菌或细胞总数，500万。

B、沉淀中NOX活力的计算:

1、组织中NOX活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA2÷0.01×V反总÷(Cpr沉淀×V样本)=2500×ΔA2÷Cpr沉淀

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g鲜重）=ΔA2÷0.01×V反总÷(W÷V样总×V样本)=505×ΔA2÷W

2、细菌或培养细胞中NOX活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA2÷0.01×V反总÷(Cpr沉淀×V样本)=2500×ΔA2÷Cpr沉淀

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/10⁴cell）=ΔA2÷0.01×V反总÷(500÷V样总×V样本)=1.01×ΔA2

V反总：反应总体积，0.25mL；V样本：加入样本体积，0.01mL；V样总：沉淀重悬体积，0.202mL；Cpr沉淀：沉淀重悬后蛋白浓度，mg/mL；W，样本鲜重，g；500，细菌或细胞总数，500万。

C、样本NOX总活力的计算:

样本NOX总活力即为上清中NOX活力与沉淀中NOX活力之和。

1、组织中NOX活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

NOX（U/mg prot）=2500×ΔA1÷Cpr上清+2500×ΔA2÷Cpr沉淀

（2）按样本鲜重计算：

NOX（U/g鲜重）=2525×ΔA1÷W+505×ΔA2÷W

2、细菌或培养细胞中NOX活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

NOX（U/mg prot）=2500×ΔA1÷Cpr上清+2500×ΔA2÷Cpr沉淀

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/10⁴cell）=5.05×ΔA1+1.01×ΔA2

（二）用96孔板测定的计算公式如下

A、上清中NOX活力的计算:

1、组织中NOX活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA1÷0.01×V反总÷(Cpr上清×V样本)=5000×ΔA1÷Cpr上清

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g鲜重）=ΔA1÷0.01×V反总÷(W÷V提取×V样本)=5050×ΔA1÷W

2、细菌或培养细胞中NOX活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA1÷0.01×V反总÷(Cpr上清×V样本)=5000×ΔA1÷Cpr上清

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/10⁴cell）=ΔA1÷0.01×V反总÷(500÷V提取×V样本)=10.10×ΔA1

V反总：反应总体积，0.25mL；V样本：加入样本体积，0.01mL；V提取：加入提取液体积，1.01mL；Cpr上清：上清中蛋白浓度，mg/mL；W，样本鲜重，g；500，细菌或细胞总数，500万。

B、沉淀中NOX活力的计算:

1、组织中NOX活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA2÷0.01×V反总÷(Cpr沉淀×V样本)=5000×ΔA2÷Cpr沉淀

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g鲜重）=ΔA2÷0.01×V反总÷(W÷V样总×V样本)=1010×ΔA2÷W

2、细菌或培养细胞中NOX活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA2÷0.01×V反总÷(Cpr沉淀×V样本)=5000×ΔA2÷Cpr沉淀

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/10⁴cell）=ΔA2÷0.01×V反总÷(500÷V样总×V样本)=2.02×ΔA2

V反总：反应总体积，0.25mL；V样本：加入样本体积，0.01mL；V样总：沉淀重悬体积，0.202mL；Cpr沉淀：沉淀重悬后蛋白浓度，mg/mL；W，样本鲜重，g；500，细菌或细胞总数，500万。

C、样本NOX总活力的计算:

样本NOX总活力即为上清中NOX活力与沉淀中NOX活力之和。

1、组织中NOX活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

NOX（U/mg prot）=5000×ΔA1÷Cpr上清+5000×ΔA2÷Cpr沉淀

（2）按样本鲜重计算：

NOX（U/g鲜重）=5050×ΔA1÷W+1010×ΔA2÷W

2、细菌或培养细胞中NOX活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

NOX（U/mg prot）=5000×ΔA1÷Cpr上清+5000×ΔA2÷Cpr沉淀

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。

NOX（U/10⁴cell）=5.05×ΔA1+1.01×ΔA2

注意事项：

1、粗酶液的提取必须在0℃- 4℃中操做完成，以防止酶变性失活。

2、比色皿中反应液的温度保持37℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4、实验时，试剂六样本在冰上放置，以免变性和失活。

5、因通过反应速率计算酶活，使用96孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数量。