表位肽竞争ELISA实验中，如何设置游离肽竞争对照？

游离肽竞争对照是用来确认信号是否来自特异性识别，同时在再生板质控里区分残留免疫复合物，下面分两种场景，一个是正式竞争体系里的游离肽竞争对照，另一个是再生空白质控配套的游离肽竞争对照，操作、排布和解读分开说。

先讲再生板空白本底测试配套的游离肽竞争对照，这组孔全程不加一抗，其余和同板再生空白孔保持一致。选用已经完成再生、漂洗中和的再生孔，封闭完成之后加入高浓度游离目标肽，这个浓度要足够高，远高于后续标准曲线里能实现充分竞争的浓度，孵育一段时间之后再加二抗，之后洗板、底物、终止全部沿用统一条件。同板设置平行的再生空白孔，也就是封闭之后只加稀释缓冲液，不加游离肽，作为参照。如果加了游离肽之后信号明显下降，说明孔上残留有能被游离肽竞争的免疫复合物，再生不；合格再生板，这一组和普通再生空白读数应当接近，游离肽不会带来明显信号变化。

再讲正式表位肽竞争 ELISA 里的游离肽竞争对照，这一组用来证明一抗结合的特异性。选用包被好目标肽的孔，在加入一抗之前预先加入梯度游离肽，包含高浓度目标肽、无关对照肽、突变肽，如果是修饰表位，还要加上未修饰同序列肽。高浓度目标肽应当显著抑制一抗结合，让信号压低到接近基线；无关肽、非关键残基突变肽几乎没有抑制效果。同时设置零抑制对照孔，只加一抗不加游离肽，用来获得体系最大信号；再设置只加包被缓冲液的空白孔，作为最低信号基线。所有孔的一抗浓度、孵育时长、缓冲体系保持不变。

试剂和浓度上有几个要点，游离肽使用和包被肽同一批次的肽，用和标准曲线一样的稀释液配制，避免溶剂干扰。高浓度竞争孔不要用助溶剂过高的肽溶液，防止把固相包被肽洗脱下来。孵育顺序固定，游离肽先和一抗共孵育，或者先加到孔内预孵育再加入一抗，整套顺序在所有对照和标准孔中统一，不要随意调换。

排布的时候，如果只是做再生板质控溯源，不需要梯度，只用一个饱和高浓度目标游离肽就足够；如果是方法学特异性验证，就设置梯度，同时带上各类对照肽。所有对照都设置复孔，方便判断是不是随机波动。

解读的时候，如果是再生质控的对照，只要游离肽能压低信号，就判定存在特异性残留，再生不合格。如果是正式实验的特异性对照，只有目标肽具备剂量依赖性抑制，其他对照肽抑制微弱，才能证明体系识别具有序列特异性；如果无关疏水肽也能产生明显抑制，说明结合偏向疏水非特异吸附，结果不可靠。