如何判断实验中是否存在封闭过度或封闭不足的情况？

先看基础读数和肉眼显色做初步判断，再用梯度对照实验确认，同时排除其他干扰因素。

先讲初步判断的思路。拿到板子读数之后，优先看阴性孔和空白孔的 OD 值。如果阴性、空白 OD 明显偏高，阴性孔肉眼能看到淡淡的显色，强阳和弱阳的 OD 都跟着一起偏高，阴阳差别变小，大概率偏向封闭不足。封闭不足是整体基线抬升，所有孔都被背景拉高，容易出现假阳性，弱阳一般不会消失，反而容易偏高。

如果阴性和空白 OD 很低，肉眼几乎没有颜色，背景看着干净，强阳性读数稳定正常，只有弱阳、标准曲线低点、接近检出限的样本 OD 明显偏低，甚至弱阳掉到临界值以下，就需要怀疑封闭过度。封闭过度的特点是选择性压低低浓度信号，高浓度抗原竞争能力强，不受明显影响，很容易因为背景好看而忽略这个问题。

初步判断只能作为线索，不能下定论，因为洗板、抗体、底物、基质效应也会造成类似现象，所以一定要做封闭梯度验证实验。梯度只改变封闭条件，其余所有步骤、试剂、孵育和洗板程序完全保持一致。设置几组不同条件，比如同一封闭液设置短时间、推荐时间、长时间，或者同一孵育时间搭配低浓度、推荐浓度、高浓度封闭液。做完之后观察变化趋势，如果随着封闭程度加强，阴性 OD 持续下降，弱阳信号变化不大，说明原来体系是封闭不足。如果随着封闭减弱，也就是降低封闭蛋白浓度或者缩短封闭时间，弱阳 OD 明显回升，阴性 OD 只是小幅上升，没有超标，就可以确定存在封闭过度。

还要留意混合情况，封闭蛋白变质聚合的时候，两种问题可能同时出现。板子局部背景斑驳不均匀，一部分阴性孔偏高，同时弱阳信号偏低，调整封闭条件之后，背景和弱阳都有改善，这就是共存的状态。

做好鉴别排除。洗板过度会造成强阳和弱阳同步下降，不是只影响弱阳，改变封闭条件不会恢复信号。抗体活性衰减也是强弱阳性一起走低，梯度封闭不会改变这个趋势。基质抑制的样本，用缓冲液稀释的抗原对照信号正常，调整封闭条件也无法提升基质样本的弱阳信号。边缘效应、加样误差带来的波动，一般是个别孔异常，不会稳定出现低浓度段信号规律性压低或者整体背景抬升。