克隆“长不出来”的常见原因与对策

| 原因 | 典型表现 | 解决方案 |

|---|---|---|

| 细胞密度过低或分布不均 | 板内空孔多，有克隆的孔很少 | 确保稀释混匀，增加接种板数量；采用FACS分选 |

| 细胞活性受损 | 单个细胞贴壁慢或24小时内死亡 | 优化胰酶消化时间，提高血清浓度，添加BCL-XL抑制剂或Y-27632 |

| 培养基不适 | 细胞形态差，不增殖 | 更换新鲜配制的培养基，加条件培养基或生长因子 |

| 培养环境波动 | 温度、pH或CO₂不稳定 | 避免频繁开门，使用稳定培养箱，减少观察次数 |

| 克隆间接触抑制 | 克隆长到一定程度停止生长 | 及时进行扩大培养，避免克隆过度密集 |

| 支原体污染 | 细胞增殖缓慢，培养基变浑浊但低密度情况下难以察觉 | 定期支原体检测，若污染需弃掉并消毒培养箱 |

| 换液操作不当 | 克隆被冲散或吸走 | 采用半量换液，沿孔壁缓慢加入，或使用不换液培养法（培养1周后再半量换液） |