碱性磷酸酶的常用底物是什么？

碱性磷酸酶（AP/ALP）常用底物

1. 比色底物（常规 ELISA 最常用：pNPP，对硝基苯磷酸二钠）

全称：p-Nitrophenyl phosphate disodium salt

AP 水解后生成黄色水溶性对硝基酚，酶标仪读 405 nm

反应条件：碱性缓冲体系（pH 9.5 左右，常用 DEA 二乙醇胺缓冲液，不能用磷酸盐缓冲液，磷酸盐会抑制 AP 活性）

终止：NaOH 终止显色

特点：操作简单、产物稳定，是 AP 标记 ELISA 的比色底物；缺点灵敏度不如发光底物

2. 化学发光底物（高灵敏度化学发光 ELISA、WB 化学发光）

属于 1,2 - 二氧环乙烷类底物，AP 水解后持续发光，不需要激发光源：

CSPD：经典，信号上升较慢，发光稳定

CDP-Star：信号更强、发光更快，搭配增强剂（Sapphire-II）灵敏度进一步提升，很多化学发光试剂盒，最大发光波长 475 nmThermo Fis...

3. 荧光底物（荧光酶免疫）

4-MUP（4 - 甲基伞形酮磷酸盐）AP 水解释放 4 - 甲基伞形酮，荧光检测；激发 360 nm，发射 450 nm，适合微量检测，普通比色 ELISA 很少用

4. 老式底物（现已基本淘汰）

β- 甘油磷酸钠、磷酸苯二钠，早期生化测 ALP 活性，ELISA 几乎不用。

快速选型

普通 AP 标记 ELISA 测抗体滴度 → pNPP

高灵敏化学发光 ELISA / 化学发光 WB → CDP-Star / CSPD

荧光免疫检测 → 4-MUP

重要注意：AP 体系缓冲液严禁含磷酸根，磷酸根会竞争性抑制酶活性。