间接ELISA检测抗体总量的操作流程中，有哪些注意事项?

一、包被阶段

包被抗原纯度要高，杂蛋白会升高背景；抗原浓度提前预实验摸索，浓度过高易造成抗原聚集、背景上升，过低则信号偏弱。

包被缓冲液推荐 pH9.6 碳酸盐缓冲液，pH 偏离会明显降低蛋白吸附能力。

包被过程避免液体蒸发，必须封板；液体浓缩会造成局部抗原浓度不均，板内孔间 CV 变大。

包被后洗板要轻柔，不要直接强力冲击孔底，防止吸附的抗原被洗脱。

包被好的板子如需保存，充分干燥密封，4℃短期存放；长期保存会导致抗原变性、信号下降，优先现包现用。

二、封闭阶段

封闭液选择：检测多克隆抗体优先考虑 1%–5% BSA；脱脂奶含有生物素与 IgG，若后续体系涉及生物素 - 链霉亲和素体系则不能用脱脂奶封闭。

封闭必须充分，否则空白位点持续吸附二抗，背景 OD 升高；但封闭时间过长也会造成抗原被封闭蛋白覆盖，降低信号。

封闭结束后务必洗板，除去游离未吸附的封闭蛋白。

三、样本、标准品加样与孵育（最容易出现基质效应、钩状效应）

基质匹配：标准品稀释基质尽量和待测样本基质一致（如血清样本用阴性血清稀释标准抗体），降低基质效应，保证定量准确。

样本梯度稀释：高浓度样本会发生钩状效应，OD 反而下降，造成浓度低估；每个样本至少设置 2 个稀释梯度，确保 OD 落在标准曲线有效区间。

标准品至少 6～8 个浓度梯度，设置复孔，减少随机误差；标准品必须和待测抗体同种属、同亚型。

加样顺序、加样速度保持一致，避免孔间孵育时长差异；加样时不要产生气泡，气泡会阻碍抗原抗体结合，造成孔内信号不均。

孵育全程封板，防止液体蒸发；温度稳定，避免温差造成结合效率差异。

必须设置全套对照：空白孔、阴性对照、阳性对照，用于扣除本底和监控整板有效性。

四、酶标二抗孵育

二抗种属必须匹配，只能识别样本抗体恒定区，不能识别包被抗原；二抗稀释比例要预实验确定，浓度过高背景飙升，过低信号不足。

二抗孵育时间不要随意延长，过长会增加非特异性吸附。

洗板是关键：洗板次数、浸泡时间统一，洗板后孔底不能残留洗涤液；残留游离 HRP 二抗会直接造成背景升高。洗板拍干动作轻柔，不要交叉污染。

五、显色与终止读板

TMB 底物避光保存，显色操作全程避光；TMB 易自发氧化，底物出现蓝色就不能使用。

显色时间统一，不能凭肉眼颜色深浅随意终止；显色过久会出现信号饱和，标准曲线上端变平，定量失效。

终止液加入顺序要和加底物顺序保持一致，减少孔间显色时间差。

终止后尽快读板，放置太久黄色产物会衰减，OD 值下降；推荐 450nm 主波长，630nm 作为参比扣除孔底划痕、浊度干扰。

六、通用质控与污染防控

所有试剂平衡至室温再使用，温度不一致会导致孔间动力学差异。

避免交叉污染：更换枪头，不同样本、不同试剂不要共用枪头。

复孔 CV 值控制：复孔 OD 变异系数过大（一般＞10%），该孔数据舍弃，提示加样、洗板操作不稳定。

标准曲线拟合：采用四参数 Logistic 拟合，不要用简单线性拟合；只使用曲线的有效线性区间计算浓度，高于上限、低于下限的样本都不能直接计算。

控制非特异性干扰：血清样本中脂血、溶血、高胆红素样本，会带来基质干扰，尽量选用清澈样本。

论文精简版（可直接复制）

实验全程应保证试剂平衡至室温，每步孵育封板防止液体蒸发；包被抗原、二抗浓度需经预实验优化。标准品基质应与待测样本保持一致，样本设置多梯度稀释规避钩状效应；设置空白、阴性及阳性对照用于质控。洗板充分，去除游离蛋白以降低背景；TMB 底物避光操作，严格控制显色时间，终止后及时读板。采用四参数 Logistic 拟合标准曲线，仅使用曲线有效区间计算抗体浓度；脂血、溶血样本慎用，避免基质干扰。