ELISA 检测抗体的含量

ELISA 检测抗体含量（定量 ELISA，测样本中抗体浓度）

原理核心：抗原包被固相载体 → 捕获样本中的目标抗体 → 酶标二抗结合抗体 → 底物显色，吸光度与样本抗体浓度在一定范围内正相关，用标准品做曲线，计算待测样本抗体含量。
类型：最常用间接 ELISA检测抗体总量；如果要测抗原特异性抗体，就是间接法；测抗体亲和力不适合这个定量。

一、基本原理

将纯化抗原固定在酶标板孔底。

加入梯度稀释的已知浓度标准抗体和待测样本，孵育；样本里的特异性抗体就会结合到板上抗原。

洗板，洗掉未结合的杂蛋白 / 非特异性吸附物质。

加入酶标记二抗（识别一抗恒定区，比如抗小鼠 IgG HRP），二抗只和已经结合在板上的目标抗体结合。

再次洗板，去除游离酶标二抗。

加入显色底物（HRP 常用 TMB），酶催化底物产生有色产物；加终止液终止反应。

酶标仪读取 OD 值；标准抗体浓度为横坐标，OD 值为纵坐标拟合标准曲线，代入样本 OD，算出样本抗体浓度。

注意：间接 ELISA 测到的是能结合包被抗原的特异性抗体，不是总 IgG；如果样本里存在不识别该抗原的 IgG，不会被计入。

二、简要操作流程

包被：抗原用包被缓冲液稀释，每孔加液，4℃过夜；弃液洗板。

封闭：封闭液（BSA / 脱脂奶）填满孔，室温 1~2h，阻断板上剩余空白位点，减少非特异结合；弃液洗板。

加标准品与样本：标准抗体做系列倍比稀释；待测样本梯度稀释（必须预实验确定稀释倍数，防止钩状效应）；孵育，洗板。

加酶标二抗：稀释好的 HRP 标记二抗，室温孵育，洗板。

显色：TMB 避光孵育，出现蓝色。

终止：加 2M H₂SO₄，颜色变黄，立刻测 OD450nm。

数据分析：四参数拟合标准曲线，计算样本抗体浓度，再乘以样本稀释倍数得到原始浓度。

三、关键要点与常见问题

标准品选择标准抗体必须和待测抗体同种属、同亚型，纯化单克隆 / 多克隆抗体，已知浓度，用来构建标准曲线。标准品基质尽量和样本基质一致（比如血清样本，标准品可用阴性血清稀释，减少基质效应）。

钩状效应（高剂量 Hook 效应）抗体浓度过高时，过量抗体同时结合包被抗原和游离抗原（间接法相对竞争法 Hook 轻，但依然存在），会造成 OD 下降，低估抗体浓度。样本必须设置多个稀释梯度，确认落在标准曲线线性区间内。

非特异性干扰血清样本中杂 IgG、内源性生物素、脂类都会抬升背景；封闭液选择、充分洗板、设置阴性对照孔（阴性血清 + 空白孔）用来扣除本底。

对照设置（定量必不可少）

空白孔：只加缓冲液，不加抗体样本，扣背景

阴性对照：不含目标抗体的同类型基质（阴性血清）

阳性对照：已知阳性样本，监控整板实验有效性

四、结果解读

OD 值越高，代表孔内结合的特异性抗体越多；仅在标准曲线有效范围内，OD 和抗体浓度正相关，超出范围不能直接计算。

结果单位：ng/mL、μg/mL 等，由标准品单位决定。

局限性：只能测抗原结合活性抗体，不能区分抗体亲和力高低；只能测能被二抗识别的完整抗体。

五、和测抗原 ELISA 区分

测抗体含量：间接 ELISA，包被抗原，样本是一抗，酶标二抗识别样本抗体。

测抗原含量：夹心法 ELISA，包被捕获抗体，样本是抗原，再加检测抗体。

如果你需要，我可以接着讲：

标准曲线拟合（四参数 Logistic）的原理；

间接 ELISA 测抗体时，基质效应与样本稀释方案；

或者一份可直接使用的 ELISA 实验方案（配方、孵育时间、浓度参考）。