BCA 法测定蛋白时，如何减少边缘效应的影响？

边缘效应本质是孵育过程中 96 孔板最外圈孔的溶剂更容易蒸发，工作液浓缩，最终造成 OD 值异常偏高或者偏低，BCA 显色体系受热之后蒸发带来的偏移会更加明显。

首先可以优先选用板内孔排布，尽量不使用最外圈的一圈孔，全部标准品、待测样本、复孔都安排在板子中间区域，最外围一圈全部空置不用。这是最简单直接的处理方式，但缺点是可使用的孔位变少，样本量大的时候一块板子放不下。

如果实验样本多，外圈孔必须要用，就采用水封的处理方式。在外圈空置的每一个孔里面加入等量的纯水，不要加 BCA 工作液，仅仅用水填充孔位，利用水汽维持板子内部湿度，降低内侧孔的溶剂挥发。注意不要把水洒到板盖上或者孔之间，避免交叉污染。

孵育的时候加盖处理，板子盖上原配的板盖之后，可以再额外盖上一张平整的铝箔。铝箔一方面减少光照，另一方面进一步降低盖子缝隙处水汽散失。不要用封口膜紧紧密封整个板子，BCA 孵育不要完全气密密封，加热孵育时内部气体膨胀有可能把封膜顶开，还容易产生冷凝水滴落到孔里面。冷凝水掉落到孔内同样会改变体积，带来读数误差，所以铝箔只是轻盖，不要压紧密封。

优化孵育环境也很关键。烘箱内部不要直接把板放在烘箱底部金属板上，金属导热快，板子底部局部温度偏高会加速边缘孔蒸发。可以把 96 孔板架在浮板或者泡沫支架上，悬空放置，让板子四周空气流通，整板受热更加均匀。尽量避免温度设置过高的孵育条件，六十摄氏度孵育蒸发风险显著高于三十七摄氏度三十分钟；对结果没有灵敏度刚需的情况下优先选择三十七摄氏度的孵育程序，可以从源头减轻蒸发驱动的边缘效应。

孵育结束之后冷却的步骤也要统一。整块板子一起室温冷却，冷却阶段依旧保留板盖和铝箔，不要掀开盖子，防止冷却阶段水分继续挥发。等到全部孔降温到室温之后再拿出来擦拭板底进行读板，冷却时间整批板子保持一致。

还有加样体积层面的小技巧。同等条件下孔里面液体总体积越大，相对蒸发占比就越小。在板子允许的范围内适当提高总反应体积，不要用很小的反应体系。比如尽量采用 25‑30 微升样本加上 200 微升 BCA 工作液的体系，尽量避开 10 微升样本加 200 微升工作液这种样本体积很小的体系；小体积体系蒸发带来的浓度波动会被放大。

布局上尽量不要把高浓度标准点全部排布在外圈位置。如果不得已要使用外圈孔，尽量分散排布高低浓度样本，不要把整组标准曲线全部放在最外围，防止标准曲线本身先受到边缘效应干扰，后续全部样本定量跟着出错。

补充一点，边缘效应没有办法做到完全消除，只能降低。正式定量实验尽量在预实验的时候先做板子排布验证，同一蛋白样本分别放置外圈和内孔进行测定，看两者 OD 差异，评估手上烘箱与板子本身的边缘效应严重程度。如果边缘和中间读数差距本身就很大，就优先放弃外圈孔，不勉强使用外圈孔做定量。