细胞培养过程中如何避免支原体污染?

细胞培养支原体污染的预防

支原体没有细胞壁，普通光学显微镜看不见；抗生素（青霉素‑链霉素）对它无效；污染后细胞不一定明显死亡，只会出现增殖变慢、转染效率下降、凋亡升高、代谢异常，还会干扰后续 PCR、WB、测序等实验，优先以预防为主，不要依赖事后加药清除。

一、环境与超净台层面（源头防控）

超净工作台定期维护

每次使用前紫外照射 30 min；台面用 75% 乙醇擦拭；风机提前开启 10‑15 min 再开始操作。

定期更换超净台的初效、高效 HEPA 滤网；不要在超净台内堆放过多耗材，保持气流通畅。

超净台内不要存放已经开封的培养基、血清，用完全部移出。

细胞房整体环境

地面、台面定期消毒（75% 乙醇、季铵盐类细胞房专用消毒剂）；定期房间紫外消毒；控制人员进出。

细胞房尽量分区：复苏传代区、换液区、冻存区；不要在同一个超净台同时处理多种细胞株，尤其不要同时处理传代量大、来源不明的细胞。

二、人员操作习惯（人为传播是支原体最主要途径）

进细胞房穿戴全套无菌服、口罩、帽子、手套；手套碰到外面物品后立刻更换；不要把手伸到培养瓶口上方。

所有瓶口开盖时间尽量缩短，瓶口倾斜，不要朝上敞口放置。

尽量减少说话；不要对着培养瓶、培养皿呼气。

不同细胞株操作之间更换手套，分时段操作；优先处理珍贵细胞，再处理普通细胞。

废液缸不要放在超净台内部；废液及时灭菌处理，支原体可以在废液残留中存活扩散。

三、试剂与耗材管控（试剂引入污染）

血清是高风险来源优先选择经过支原体检测阴性的胎牛血清；血清建议分装保存，避免反复冻融；不要混用不同批次血清。

注意：热灭活血清并不能杀灭支原体，灭活只补体，不能作为防支原体手段。

培养基、胰酶等
尽量购买商品化无菌预配培养基；自配培养基过滤使用0.22 μm 滤膜负压过滤；过滤完成后留样做支原体检测再投入使用。

一次性耗材尽量不要二次复用；玻璃器皿严格高压灭菌。

不建议日常体系中长期添加支原体清除抗生素（如 Plasmocin）。长期添加会掩盖污染，诱导支原体耐药，污染持续潜伏。只适合临时救急，不作为常规预防。

四、细胞本身的管理（细胞交叉传染）

新引进细胞必须隔离检疫新收到的细胞不要直接和原有细胞同个超净台、培养箱。单独隔离传代 2‑3 次，取样做支原体检测（PCR 法最灵敏；也可用 Hoechst 荧光染色），确认阴性之后再并入日常培养。

建立细胞冻存备份
早期低代次细胞冻存备份；一旦发现污染整株直接丢弃，不要尝试挽救珍贵株以外的污染细胞。

培养箱管理

CO₂培养箱水盘是支原体重要污染源！水盘里面不要直接加自来水，建议用无菌超纯水，可以添加培养箱专用抑菌剂；每周更换水盘的水，定期擦拭内胆；

培养箱不要堆放过满；尽量不要敞门太久；定期整体高温消毒内胆。

湿盒里面不要遗留洒漏的培养基废液，洒漏立刻擦拭消毒。

五、常态化监控策略（早发现）

定期抽检正在培养的细胞，建议每 2‑4 周做一次支原体 PCR 筛查；

发生过支原体污染之后，整个细胞房、超净台、培养箱全部消杀，再恢复细胞操作；

一旦确认某瓶细胞支原体污染，时间密封丢弃，该超净台暂停使用，消毒；同批次邻近的细胞全部取样检测排查交叉污染。

小结关键点

支原体污染的三条主要路径：操作人员气溶胶飞沫→培养箱水盘环境→外来引进细胞 / 血清。
预防核心：严格检疫新细胞，管好培养箱水盘，规范无菌操作，定期监测；不要依靠抗生素预防。