蛋白提取和酶活性测定的具体操作步骤

一、粗酶蛋白提取（以动物组织为例，冰上全程操作）

预冷仪器与试剂。提前将匀浆器、EP 管、非变性提取缓冲液置于冰上，离心机预冷至 4 ℃。

称取新鲜或者‑80 ℃保存的组织样本，吸干表面水分，按照质量体积比 1:5‑1:10 加入预冷的非变性提取缓冲液（缓冲液根据酶的需求添加蛋白酶抑制剂、DTT、金属离子辅因子）。

冰上进行匀浆，间断研磨，防止匀浆过程摩擦产热造成酶失活。匀浆完成之后将匀浆冰浴静置 15 min，使可溶性酶蛋白充分溶出。

将匀浆转移至离心管，4 ℃、12000‑14000 g 离心 15‑20 min。

小心吸取中间澄清的上清液，即为粗酶液；避开上层浮脂和底部细胞碎片沉淀。粗酶液置于冰上待用，多余样本分装后‑80 ℃保存，避免反复冻融。

二、粗酶液蛋白定量（BCA 法）

配制 BCA 工作液，按照说明书比例混合 A 液与 B 液。

设置蛋白标准品梯度，同时加入待测粗酶液；每个样品设置平行。

加入 BCA 工作液，混匀之后 37 ℃避光孵育 30 min。

562 nm 测定各孔吸光度，根据标准品的吸光度绘制标准曲线，计算粗酶液当中总可溶性蛋白浓度。

三、酶活性测定（分光光度动力学法）

提前预热分光光度计或者酶标仪，设置实验所需反应温度；配制好反应缓冲液、底物溶液。

设置试剂空白管、样本本底对照管（粗酶液煮沸灭活）以及待测样品管。

向各个试管中依次加入反应缓冲液、粗酶液；混匀保温数分钟，使体系达到预设反应温度。

加入底物溶液启动酶促反应，迅速充分混匀，立刻上机开始动力学检测，记录一段时间内吸光度随时间的变化。

选取吸光度‑时间曲线的线性部分，计算每分钟吸光度变化值 ΔA。

四、数据计算

根据摩尔消光系数由 ΔA 计算酶活力 U；再除以对应粗酶液的蛋白浓度，算出比活 U/mg prot。

补充说明：如果是植物组织样本，提取缓冲液中额外添加 PVP‑40 和抗坏血酸；细胞样本直接用预冷非变性裂解液冰上裂解 20‑30 min，之后离心取上清即可，不需要组织匀浆步骤。