如何确定PCR实验中模板DNA的用量?

核心原则：模板量过少→扩增不出；模板量过多→抑制 PCR、非特异性扩增、引物二聚体、背景高。不同模板（质粒、基因组 DNA、cDNA）推荐量差异很大。

一、各类模板常规推荐用量（25 μL 反应体系）

质粒 DNA（高拷贝，模板浓度高）
推荐：1–10 ng质粒浓度很高，加太多极易抑制 PCR，很多时候 0.5 ng 也能成功。

基因组 DNA（gDNA）（人 / 动物基因组，庞大）
推荐：10–100 ng

人基因组 DNA：1μg ≈ 3×10⁸拷贝，不要超过 200 ng，过量会严重抑制。

cDNA（反转录产物）推荐：1–5 μL 反转录产物（不超过总体系 1/10 体积），一般对应几十 ng 级别。

细菌 / 真菌菌液模板（菌落 PCR）挑取少量菌落，不要太多菌体，过多会带入多糖、蛋白抑制物。

👉 换成 50 μL 体系：模板量加倍即可。

二、计算模板拷贝数（可选，精确定量）

660：双链 DNA 平均分子量；6.022e23 阿伏伽德罗常数。

PCR 理想起始拷贝：10² ~ 10⁴拷贝，太少扩增不稳定，太多容易非特异。

三、实操确定策略（最常用：梯度测试）

当不知道合适模板量时，做模板浓度梯度 PCR：

先测 DNA 浓度（Nanodrop、Qubit，优先 Qubit，Nanodrop 会高估含杂质样品）

设置梯度，例如 gDNA：5 ng、20 ng、50 ng、100 ng、200 ng

电泳看结果：

条带弱 / 无条带：模板偏低，可适当增加

目的条带亮，但杂带多、拖尾：模板过高，降低模板量

目的条带单一明亮：这个量就是用量

⚠️ 注意：加入模板的体积不能超过 PCR 总体系 10%例：25 μL 体系，模板 + 水最多占 2.5 μL，避免模板里的缓冲液、EDTA 等抑制 PCR。浓度低的样品，不要一次性加过大体积。

四、影响模板适宜用量的关键因素

DNA 纯度：有蛋白、酚、EDTA、多糖污染 → 降低模板最大允许量，杂质本身抑制 PCR。

目的片段长度：长片段 PCR（>2 kb）模板要更少，长片段更容易断裂，过量杂质抑制更明显。

PCR 酶性能：高保真酶（如 Phusion）对抑制剂更敏感，模板量通常比普通 Taq 略低。

样品来源：石蜡包埋 DNA、土壤 / 环境 DNA 高度降解，可适当增加模板，但杂质风险同步上升。

五、常见踩坑提醒

不要只看 Nanodrop 的 A260 浓度，杂质会虚高浓度，导致加样过量。

模板不要反复冻融，降解后有效模板拷贝下降。

阴性对照（不加模板）一定要做，判断是否有污染。

快速总结

优先参考模板类型的推荐范围；未知样品做模板梯度；控制模板加入体积≤体系 10%；纯度差的样品要减少模板量。