如何确定 PCR 实验中模板 DNA 的合适浓度？

一、先记住大致参考范围（初试用）

不同模板类型差异很大，这是常规 50 μL 体系参考：

基因组 DNA (gDNA)：20–200 ng / 反应；优先从 50 ng 开始试

质粒 DNA：1–100 pg / 反应（质粒拷贝数高，非常少就够）

cDNA：1–50 ng / 反应（反转录产物，浓度不要太高）

短片段扩增耐受范围更大；长片段 PCR、qPCR 对浓度更敏感，范围更窄。

二、梯度预实验（最标准方法，写实验报告推荐）

设置模板浓度梯度进行 PCR，根据条带 / 结果判断最佳浓度：

梯度设计示例（gDNA）：10 ng、50 ng、100 ng、200 ng、400 ng per 反应

判断标准：

浓度太低：目的条带很弱或者无条带，平行重复性差

浓度合适：目的条带明亮单一，杂带少

浓度太高：杂带增多、背景重，甚至目的条带反而减弱（模板抑制）

qPCR 则看 Ct 值：Ct 落在 20–30 区间一般比较合适；Ct＜18 提示模板过量，Ct＞35 拷贝数太低。

三、结合分光测值初步估算（Nanodrop）

测 A260 得到 DNA 浓度（ng/μL）

根据体系体积，计算需要加入的模板体积

注意：Nanodrop 会把 RNA、杂质也算进浓度，测出的浓度是表观浓度，不是有效模板拷贝数，只能做初步参考，不能替代梯度试验。

四、几个重要原则

模板加入体积尽量不超过总体系 10%比如 25 μL 体系，模板加样≤2.5 μL。防止带入过多杂质，改变体系盐浓度、Mg²⁺浓度。

样本类型调整：

血液、植物组织提取的 gDNA 含较多抑制剂：选偏低浓度，避免抑制

菌落 PCR、粗裂解模板：本身纯度差，不要加太多

目的：找到能得到清晰目标条带，同时杂带最少的最低够用浓度，不是越高越好。

五、简答版（思考题直接抄写）

先查阅文献确定模板浓度参考范围；测定 DNA 浓度，设置模板浓度梯度进行 PCR 预实验。观察电泳条带（qPCR 观察 Ct 值）：条带明亮、杂带最少的浓度即为合适浓度；模板加样体积不超过反应体系 10%。DNA 浓度测定仅为表观浓度，最终需要依靠梯度 PCR 结果确定最佳模板量。