荧光抗体稀释时，需要注意哪些细节？

荧光抗体稀释首先优先遵从说明书给出的用量，没有通用固定稀释倍数，很多人习惯直接按体积倍数稀释很容易出现问题。

稀释介质的选择是个关键点。表面染色只能用流式染色缓冲液，也就是 PBS 补充 BSA 或者胎牛血清，不要用纯水，也不要直接用完全培养基稀释抗体。纯水会造成渗透压变化损伤细胞，培养基里面的酚红、多种蛋白成分会增加非特异性吸附，升高背景荧光。做胞内或者核内染色的时候，稀释介质必须更换成穿孔缓冲液，继续使用普通含 BSA 的缓冲液会让抗原结合环境不对，阳性信号变弱，背景杂峰变高。

稀释的操作方式分预稀释和管内稀释，各自有需要留意的地方。预稀释适合批量样本，先在离心管里把抗体和缓冲液充分混匀之后再加到细胞沉淀上，一定要充分涡旋混匀再分装，避免抗体局部浓度分布不均，造成管与管之间染色结果差异。管内稀释就是直接把抗体原液加到已经定好体积的细胞悬液里面，这里切忌先加抗体，之后再补缓冲液，局部瞬间高浓度的抗体会直接吸附在部分细胞表面，产生很强的非特异染色，缓冲液要先和细胞混匀，体系体积确定之后再加抗体原液，轻柔吹打混匀。

稀释体系体积和细胞量要相互匹配。抗体终浓度是由抗体用量、体系体积、细胞总数三者共同决定的，只看抗体加多少微升而忽略细胞数量，很容易染色异常。细胞数目过高，同等抗体用量下抗体相对不足，阳性峰就会压低变宽；细胞太少，抗体相对过量，非特异性结合就会加重。常规每管十万到五十万细胞，染色总体积五十到两百微升是比较常用的区间，如果细胞数量明显上调，抗体用量也应当适度增加，通过预实验梯度确定用量。

稀释之后的保存问题很重要。荧光抗体工作液必须临用现配。荧光基团稀释暴露在缓冲液环境下稳定性下降，提前一天配好放置，会发生荧光淬灭，信号直接下降。原液母液避光负二十摄氏度分装保存，尽量避免反复冻融；已经稀释开的抗体工作液不能回收再冻存，直接废弃。

避光的细节从稀释阶段就要开始，不只是孵育的时候避光。稀释混匀过程尽量减少灯管直射，离心管或者流式管选用避光放置，强光会直接造成荧光基团淬灭，还没上细胞就已经损失信号。

还有一些容易忽略的细节。稀释混匀的时候不要剧烈涡旋震荡，剧烈震荡有可能造成荧光基团光损伤，也容易产生大量气泡，气泡会破坏部分细胞膜，增加非特异吸附，轻柔涡旋或者反复吹打混匀就足够。如果做多色流式，多种荧光抗体预混合稀释的时候，尽量先把缓冲液配好，再依次加入不同的荧光抗体，混匀之后再加细胞，不同荧光抗体之间尽量不要原液先行混合再稀释，部分荧光基团之间有可能发生相互作用。另外稀释缓冲液里面叠氮钠浓度维持在很低的水平就可以，过高浓度的叠氮钠会抑制部分抗原抗体结合反应，反而降低染色信号。
预实验摸索抗体用量的时候，不要只看阳性信号强弱，同时观察阴性群体的背景，优先选择阳性阴性峰分离的那一档，不是抗体加得越多信号就越好，过量只会抬升背景，分离度反而变差。