如何判断回收抗体是否可以继续使用？

回收抗体能不能继续使用，不能依据保存时长、回收次数来定，需要依次完成三级筛查：肉眼液体初筛 → 活性质控（结合能力） → 特异性质控（含非特异性背景评估），全部通过才可以继续使用；任意一级不通过直接丢弃。

级：肉眼背光初筛（步粗筛）

按照背光透视的方法观察回收抗体液体。轻柔颠倒混匀后静置，消除气泡干扰，同时拿新鲜缓冲液做透光对照。

如果出现雾状朦胧浑浊、悬浮絮丝、管底大量沉淀，直接弃用。

若仅管底有少量膜碎屑杂质，可以低速 2000‑3000 g 离心 2‑3 min，只吸取上层上清继续往下做质控；离心之后上清依旧发雾，直接丢弃。

重点：肉眼清亮只是通过道关卡，清亮不等于合格，必须继续做实验质控。

第二级：活性质控，确认抗原结合活性还保留

目的确认抗体还可以有效识别靶抗原，判断信号保留程度。
选用阳性质控样本，同一批样本，设置新鲜抗体作为平行对照，孵育、洗涤、显色 / 曝光全部条件严格统一。
比较回收抗体与新鲜抗体的靶条带（或染色）信号。
‑ 靶信号保留大约 70% 以上，活性初步合格；
‑ 信号明显下降（低于 40%），直接弃用；
‑ 介于 40‑70%，活性已经衰减，只可考虑预实验，正式实验不要使用。

这里只看阳性信号还不够；活性合格不代表特异性没问题，很多情况活性尚存但背景已经抬升。

第三级：特异性与背景质控（最关键一步）

这一步需要同时带上KO / 生物学阴性样本、新鲜抗体平行对照。
统一实验平台：回收抗体后续做 WB 就用 WB 验证；后续 IF/IHC 就用对应切片或细胞；不要跨平台验证。
需要同时检查下面三点：

阴性 KO 样本靶抗原对应位置没有特异性信号；

和新鲜抗体对比，没有新增杂条带（WB）或者广泛弥散染色（IF‑IHC）；

弥散的整体本底背景没有明显上升，可以借助灰度辅助定量评估背景。

判读结果：
✅全部三点都满足：特异性、背景合格。
⚠️靶信号尚可，但阴性样本出现信号、新增杂带、整体背景明显抬升 → 特异性受损，直接丢弃。

全部筛查通过之后，还要明确使用边界

即使三级筛查全部合格，回收抗体依然存在隐患：溶液中免疫复合物还会随后续孵育持续累积，会慢慢劣化。

每一次拿出来复用之前，整套筛查都要重新走一遍，不能一次质控之后反复无限次使用；

经过质控合格的回收抗体预实验、条件摸索；正式投稿产出数据，一律优先新鲜配制抗体工作液。

简要实操判定流程总结

背光肉眼观察液体：浑浊、雾感、大量沉淀 → 丢弃；少量碎屑离心取上清。

平行对照测活性：靶信号衰减严重 → 丢弃。

使用 KO 阴性样本 + 新鲜抗体平行对照，核查特异性与背景；阴性出现信号、杂带、背景升高 → 丢弃。

三级全部通过，仅用于预实验；下次使用前重新复核。

补充提示：保存温度、容器、添加叠氮钠只起到延缓变质的作用，保存条件再好，也不能替代以上三级筛查来判定是否可用。