抗体特异性受损的原因有哪些？

这里主要区分两大类情况：一类是回收复用抗体工作液发生的特异性变差，另一类是抗体本身固有的问题。下面重点针对回收抗体的场景展开分析。

一、IgG 抗体分子自身结构发生改变（抗体本体损伤）

局部变性与疏水聚集储存温度不合适、冻融、震荡、温度反复波动，会让 IgG 结构部分解开。Fab 抗原结合区域有可能还保留识别靶抗原的能力，但是 Fc 区域疏水氨基酸暴露。暴露的疏水表面会非特异性吸附 PVDF 膜、细胞或者组织上的各类蛋白，结果就是靶信号还存在，但整体背景升高，杂带变多。很多时候只是形成可溶性寡聚体，肉眼观察液体依旧清亮，看不到沉淀。

蛋白酶水解切割 IgG回收过程中会从膜、细胞裂解物、组织切片带入微量宿主来源的蛋白酶；另外回收液长菌之后微生物也会分泌蛋白酶。蛋白酶优先剪切 IgG 铰链区，把完整抗体切为 Fab 片段和 Fc 片段。游离的 Fc 片段本身没有抗原识别功能，但是疏水吸附能力很强，会造成大量非特异背景；残存的 Fab 还可以识别靶抗原，于是就出现靶带尚可，特异性已经坏掉的典型现象。

氧化损伤长期 4℃存放，容器内残留空气较多，IgG 氨基酸侧链发生氧化。主要发生在可变区（Fab），会改变表位识别的选择性，既可以造成亲和力下降，也有可能改变识别特性，增加交叉识别的概率。

二、回收工作液体系内累积外源组分（不是抗体蛋白本身变性）

可溶性抗原‑抗体免疫复合物不断累积每一次孵育之后，会从膜上洗脱下来少量靶抗原碎片。抗原碎片和体系内的游离抗体结合，形成悬浮于溶液里的小分子免疫复合物。这些复合物不会沉淀下来，肉眼看不到；在后续孵育的时候，免疫复合物会物理吸附到 PVDF 膜或者细胞切片上，产生额外杂信号。

注意这个过程 IgG 的 Fab 结构本身没有被破坏，但是溶液里面多了复合物杂质，表观上表现为特异性变差。这是回收抗体最常见的诱因。

样品杂质持续带入回收液反复孵育回收时不断带入膜碎屑、组织残渣、封闭液中的 BSA 碎片。这些蛋白碎片既可以充当吸附核，诱导 IgG 发生聚集；本身也会和抗体发生疏水相互作用，抬高整体背景。

微生物增殖污染回收液含有蛋白，抑菌不足时细菌缓慢增殖。一方面释放蛋白酶水解抗体；菌体本身、菌体蛋白也会混入体系，引入非特异吸附与杂信号。叠氮钠可以抑制细菌生长，但不能清除已经生成的水解片段和免疫复合物。

三、保存与操作带来的间接诱因

保存容器选择不当容器材质不合适，管壁吸附部分 IgG；或者密封不好溶剂挥发，缓冲液盐、去污剂浓度被动升高。高盐或者过高 Tween‑20 会改变 IgG 分子的溶解度，促进局部构象改变与聚集。

反复冻融（回收稀释工作液最忌讳）稀释后的抗体蛋白浓度低，缺少高浓度原液的蛋白保护。结冰‑融化产生的相界面应力诱导 IgG 局部解折叠，直接促进疏水寡聚体生成。

四、抗体本身固有的特异性缺陷（不属于回收造成）

买回来的原始抗体本身就存在多克隆固有的交叉识别，这种问题从一开始就存在；回收之后只是放大显现出来。也就是新鲜的时候就有微弱杂带，回收之后聚集、复合物累积让杂信号进一步加重。

小结（回收抗体验证的启示）

特异性受损分两种情形：一是 IgG 分子本身构象被破坏；二是溶液累积免疫复合物、蛋白杂质带来的杂质干扰。
两类情况肉眼大多无法分辨，都只能依靠 KO 阴性样本平行实验去检出；单纯观察液体外观不能作为判断依据，所以回收抗体每一次使用前都必须做特异性的质控验证。