抗体重复使用时，如何确定抗体的特异性?

抗体重复使用之后，不能只看靶条带还亮不亮，经常会出现靶信号还保留，但特异性已经变差的情况。根源来自回收体系里发生的几类变化，IgG 局部变性疏水暴露、从膜上洗脱下来的游离抗原与抗体形成可溶性免疫复合物、微量蛋白酶水解抗体产生 Fc 片段，这些因素都会提升非特异吸附，而抗原识别位点还没有完全失活。所以特异性的判定必须使用对照样本，而不是只观察回收抗体液体外观。

首先做液体的前置筛查。观察回收后的抗体工作液，如果已经出现浑浊、细小絮状物或者沉淀，直接判定特异性已经受损，不再继续使用。液体保持清亮也不等于特异性完好，清亮只能说明没有发生大规模聚集，局部的部分变性以及可溶性免疫复合物肉眼是看不出来的，这一步仅仅作为初筛，不能作为结论。

接下来最重要的原则，验证特异性的实验平台尽量和你之后正式使用的平台保持一致。回收抗体如果后续做 WB，就用 WB 体系验证；后续做 IF、IP，就直接用 IF 或者 IP‑Western 来复核，不要全部依靠 WB 的结果。因为抗体回收造成的构象损伤更多影响天然状态的抗原识别，变性 WB 有可能看不出特异性下降。

验证的时候样本设置是关键，一定要同时准备三类样本，高表达靶蛋白的阳性样本，靶基因敲除或者确认不表达靶抗原的生物学阴性样本，分子量标记。同时保留同一批次新鲜配制的该抗体做平行对照，所有孵育、洗涤、显色或者曝光条件全部统一。

以 WB 回收抗体举例，同一批转印得到的膜，分成两份，一份孵育回收抗体，一份孵育新鲜抗体。两份膜上都同时点样阳性样本和 KO 阴性样本。判读的时候同时观察四个方面，阳性样本靶分子量位置的靶条带信号强弱，KO 阴性样本同一分子量位置是否出现条带，膜上是否新增其他大小的杂条带，整张膜弥散的雾状背景高低。
合格的判定结果是阳性样本出现目标条带，KO 阴性样本对应位置没有信号，杂条带数量和亮度、整体背景和新鲜抗体相比没有明显上升。即使靶条带亮度有小幅下降，只要阴性没有假阳性，杂带没有增加，就认为特异性还保留。

如果阳性还能看到靶条带，但是 KO 样本出现了条带，或是多出很多杂带，或是整张膜背景明显加重，此时虽然还有靶结合活性，但特异性已经损坏，应当直接弃用，不可以继续用于正式实验。回收液中累积的可溶性抗原‑抗体复合物就是造成这类现象很常见的诱因，复合物吸附在膜上产生额外杂信号。

如果是回收之后用于免疫荧光或者免疫组化，就使用阳性细胞或组织切片搭配 KO 阴性切片，新鲜抗体平行对照。观察阳性切片的染色位置是否符合蛋白已知的分布，KO 切片是否没有特异性染色，同时观察是否出现广泛弥散的非特异着色。只要阴性切片出现明显染色，就判定特异性丢失。
回收抗体用于 IP 的话，用 IP‑Western 进行复核，设置同亚型 IgG 对照，看是否会非特异沉淀无关蛋白，区分开抗体的非特异性抓取和靶蛋白天然的相互作用蛋白。

还要注意阴性对照的选择优先级，优先基因敲除的样本作为阴性，同型 IgG 对照只作为辅助，单纯空白封闭对照只能看背景高低，无法检出抗体对其他内源蛋白的交叉识别。

另外还有一个现实局限，本次质控验证合格，仅代表当前这一批回收液当下的状态。随着继续反复回收孵育，游离抗原碎片、水解片段会持续不断累积，特异性依旧会缓慢衰减。所以每一次重新拿回收抗体使用之前，都建议完成这套特异性复核，不要根据回收次数直接划定使用上限。预实验可以酌情使用经过质控合格的回收抗体，正式用于投稿的数据依然优先使用新鲜配制的抗体。