除了 WB 实验，还有哪些实验可以评估抗体的特异性结合能力？

我们先理清一个核心思路，不同实验对应的抗原构象是不一样的，WB 只能检测变性之后的线性表位，无法反映抗体在天然蛋白条件下的特异性。如果要完整评估一支抗体的特异性结合能力，需要根据后续实际使用的实验平台来选择验证手段，不建议只依靠 WB 的结果下定论。

免疫沉淀结合 WB 也就是 IP‑Western 是在裂解液的液相环境下完成的，蛋白维持天然构象。利用抗体从细胞总裂解液中将靶抗原沉淀下来，再通过 WB 检测沉淀组分。实验同时设置同亚型无关 IgG 作为阴性对照。合格的结果是抗体组可以富集到靶蛋白，同型 IgG 对照组在对应分子量位置没有信号。这个方法可以发现一类问题，有些抗体在变性 WB 条带很干净，但是到天然溶液环境就会非特异性吸附很多杂蛋白。需要注意区分结果里的杂蛋白，有些是靶抗原生理状态下的相互作用蛋白，并不是抗体本身发生了交叉识别。

重组抗原 ELISA 采用纯化的靶重组蛋白包被固相，同时平行包被序列同源性较高的家族蛋白。用待评估的抗体孵育所有包被孔，读取吸光值。理想情况下抗体只对靶抗原产生明显信号，同源蛋白的读数接近本底水平。这个方法主要用来评价抗体对同源异构体或者同家族蛋白之间的交叉反应。局限在于固相包被之后重组蛋白的空间结构会发生一定改变，而且重组蛋白本身的纯度缺陷也会干扰最终的信号。

免疫荧光 IF 在完整固定细胞上开展，优先选用靶基因敲除的细胞系作为阴性对照。野生型细胞可以观察到符合文献报道的亚细胞定位荧光信号，敲除细胞几乎看不到特异性的荧光，同时整张细胞视野没有大面积弥散的背景染色。这个验证是在细胞原位进行的，可以检验细胞内部环境中抗体会不会非特异结合胞质或者细胞核内其他组分。固定通透步骤有可能破坏部分构象型表位，所以还需要搭配同型 IgG 对照排除固定带来的疏水吸附背景。

流式细胞术既可以用于活细胞表面抗原染色，经过通透之后也可以检测胞内抗原。平行处理野生型细胞和基因敲除细胞，使用待检抗体加上二抗完成染色之后上机采集荧光信号。合格时野生型细胞的荧光发生明显偏移，敲除细胞的荧光分布和空白以及同型 IgG 对照组基本重合。流式的优势在于结果是定量的，可以得到阳性细胞占比和平均荧光强度，更适合膜抗原抗体的特异性评估，胞内染色时通透试剂本身会带来额外的背景干扰。

免疫组化 IHC 可以使用石蜡切片或者冰冻切片，实验需要同时准备阳性野生组织以及敲除动物的同源组织切片作为阴性样本。合格的染色结果里，阳性组织的着色分布和该蛋白已知的组织表达模式保持一致，敲除组织看不到特异性染色，间质和细胞核不存在大范围弥漫的非特异着色。这个体系模拟了复杂的组织基质环境，能够检出部分抗体在细胞 IF 结果尚可，但进入组织切片后出现广泛非特异结合的情况。抗原修复的条件会很大程度上改变表位状态，验证的时候要采用后续正式实验完全一样的修复流程。

免疫沉淀联合质谱也就是 IP‑MS 属于比较高阶的全局验证手段。用抗体完成免疫沉淀之后，质谱无偏向性鉴定所有被抗体抓取下来的全部蛋白。对比野生样本和敲除样本的富集蛋白列表，理想结果中靶抗原是富集程度最高的蛋白，其余富集到的蛋白大多是已经报道过的靶蛋白互作分子，不存在大量无关蛋白被富集出来。这套方法可以发现未知的交叉识别靶点，缺点是成本偏高，裂解缓冲液的条件也会影响蛋白复合物的保留，后续数据分析还需要仔细区分抗体直接交叉结合和生理蛋白互作。

肽点阵 Pep‑spot 主要针对识别线性表位的抗体。合成一系列覆盖靶蛋白全长的重叠短肽，同时加入同源蛋白对应的肽段点在膜上，用抗体孵育显色。可以直接定位抗体识别的氨基酸序列，筛查它是否识别同源蛋白上相似的肽段。构象依赖型抗体在肽点阵上一般得不到信号，因此该方法不适用于构象表位抗体。

回到回收复用抗体的实际质控层面，有几点实践原则。WB 得到的只是变性条件下的结果，抗体回收储存后发生的结构损伤很多体现在天然蛋白识别这一侧。如果回收抗体后续用于 IP，就优先用 IP‑Western 复核特异性；后续用于 IF 或者 IHC，就直接采用对应的细胞或者切片平台加上 KO 阴性样本做验证。所有的特异性验证当中，基因敲除样本是优先选择的阴性对照，同型 IgG 对照只能作为辅助，只设置空白封闭对照仅仅可以评估非特异背景，无法证明抗体不存在对其他蛋白的交叉识别。回收抗体一般不需要开展 IP‑MS 或者肽点阵这类高通量的深度验证，选择与下游应用一致的实验体系做复核就足够。