如何预防细胞培养过程中的细菌污染?

细胞培养细菌污染的防控核心分为环境管理、试剂耗材管控、操作规范、日常监测和污染早期阻断几个层面，细菌繁殖速度快，一旦污染很容易短时间内整瓶报废，预防优先于处理。

环境方面，超净台使用前需要紫外照射三十分钟，同时开启风机运行十分钟，台面用 75% 乙醇擦拭；操作全程保持超净台内气流稳定，不要遮挡出风口，台面只放置本次实验必需物品，减少杂乱物品带来的落菌。细胞培养箱要定期清洁，内壁、水盘定期用 75% 乙醇擦拭，水盘里建议添加抑菌剂，避免水体滋生细菌，培养箱门尽量减少频繁开关，维持稳定温度湿度。细胞房地面和台面定期消毒，区分洁净区和非洁净区，不要在细胞房吃东西、存放个人物品。

试剂耗材上，所有直接接触细胞的液体都要做无菌处理，胎牛血清、培养基按照要求分装，避免反复开盖造成污染；培养基常规添加抗生素用于预防性防护，但不能依赖抗生素，抗生素只能抑制细菌，无法完全杀灭，长期使用还会掩盖低度污染，诱导耐药菌。一次性耗材比如培养瓶、移液管选用无菌独立包装，拆包装时注意不要触碰管口和瓶内接触面；玻璃器皿需要经过高压灭菌，灭菌后烘干存放，存放时间过长要重新灭菌。新配的培养基、缓冲液提前做无菌预实验，放置在 37℃孵育两天观察有无浑浊，确认无菌再使用。

操作规范是最容易引入污染的环节。进入细胞房更换无菌服、手套和口罩，手套用 75% 乙醇喷洒消毒；操作时尽量在超净台中部进行，远离风口边缘。所有瓶盖开口之后保持斜向上，不要敞口放置，移液枪枪头不要接触瓶口外侧、台面或者手指。不同细胞株操作分开进行，优先处理状态好的细胞，处理可疑污染细胞，避免交叉污染。移液操作不要混用枪头，倾倒液体尽量避免产生气溶胶。操作结束后再次擦拭超净台，关闭紫外。

样本和细胞本身的质控，复苏新细胞的时候，单独培养观察两到三天，确认没有浑浊、镜下无杆状或者球状细菌之后，再和现有细胞一起操作。原代组织取材时，取材器械和浸泡缓冲液要无菌，组织表面可以用无菌 PBS 清洗去除表面杂菌。传代的时候控制操作节奏，不要长时间把培养瓶敞开放置。

日常监测方面，每次换液和传代前都用肉眼观察培养基，细菌污染典型表现是培养基快速变浑浊，有时伴随黄色变化，倒置显微镜下可以看到大量点状或者杆状颗粒物，会自主运动。定期留取空白培养基放置孵育，监测环境是否存在隐性污染。

一旦怀疑细菌污染，立刻把污染细胞转移出超净台，单独高压处理，不要继续传代，防止污染扩散到其他细胞和整个培养箱。抗生素只适合早期轻微污染尝试挽救，重度污染直接丢弃，继续使用会造成整个细胞房大面积污染。

还有一些容易忽略的点，水浴锅温度高，水体很容易长菌，融化血清和培养基的时候，试管外壁做好密封，不要让水浴锅里的水沾到管口，拿出来之后擦拭管壁再进超净台。液氮罐里冻存管也有可能携带细菌，复苏时留意管口，防止液氮碎屑带入培养体系。