如何降低 DDA 模式下的假阴性？

DDA 模式的核心短板是数据依赖采集，仪器只会挑选强度靠前的母离子做二级碎裂，大量低丰度肽段直接被跳过，这也是假阴性最主要的来源。降低假阴性本质就是提升低丰度肽段被选中碎裂的概率，同时减少样品、色谱、质谱前端带来的损失。

从样品前处理入手，首先保证蛋白提取和酶切的稳定性。蛋白尽量避免过度降解，减少可变修饰带来的肽段种类碎片化；酶切要充分，不完全酶切会产生长肽段，这类肽段电离差、保留行为不稳定，很容易丢失。可以优化酶解时间、酶和蛋白的比例，必要时用两步酶切。脱盐步骤也要控制，疏水性过强或者极性极强的肽段容易在 C18 小柱上损失，洗脱条件不要过度严苛，同时尽量减少脱盐循环次数，避免低丰度肽段持续流失。样品上样量需要合理评估，不要盲目无限加大上样量，过高上样会造成色谱柱过载，峰形变差，离子抑制加重，反而让部分低丰度肽段信号被掩盖；适度提升上样量，在不超载的前提下提高肽段的信号强度。

色谱分离的优化可以减少共洗脱，降低离子抑制。采用梯度洗脱，延长梯度时长，把复杂肽段混合物拉开，减少多个母离子在同一时间窗口共流出的情况，避免高丰度母离子抢占碎裂机会。色谱柱的选择也很关键，小粒径、窄内径色谱柱提升分离度，减少峰宽；同时稳定柱温，减少保留时间漂移带来的峰展宽。另外要控制流动相的纯度，杂质带来的背景噪声会抬高基线，掩盖低丰度肽段信号。

质谱仪器参数设置是 DDA 降低假阴性最直接的环节。首先调整母离子选择窗口，优先放宽母离子质量窗口，同时调整动态排除参数。动态排除时间不要设置过长，太长会导致丰度下降后的真实母离子长时间被屏蔽；但也不能太短，避免同一母离子反复被碎裂，浪费扫描时间。动态排除的质量偏差也要合理设置，减少误排除。其次，增加一级扫描的分辨率，降低基线噪声，让低丰度母离子能够被仪器识别出来；合理设置母离子强度阈值，阈值不要设太高，否则低丰度母离子直接不被纳入候选列表，但阈值过低会引入大量噪声母离子，消耗二级扫描时间。还可以调整每轮一级扫描之后触发的二级碎裂数目，在扫描周期允许的范围内增加 MS/MS 采集数量，一轮一级谱之后更多母离子可以被碎裂，捕获更多低丰度信号。部分仪器支持排除单电荷母离子，大部分肽段是 2+、3 + 电荷态，过滤掉单电荷噪声离子，可以节省扫描时间留给有效母离子。

也可以从数据采集策略层面优化。分馏是非常有效的手段，将肽段混合物通过液相或者强阳离子交换等方法分成多个组分，每个组分复杂度下降，减少高丰度肽段压制低丰度肽段的现象，缺点是样品消耗更多、上机时长增加。如果样本量有限，不适合分馏，可以采用多次重复进样，同一来源样品多次采集，DDA 每次选中的母离子存在随机性，多次采集可以互补，增加肽段覆盖度，但重复进样对于生物学重复的设计需要考虑。

数据库搜索阶段也可以减少搜索层面带来的假阴性。匹配时的质量容差要和仪器实际分辨率匹配，不要设置过窄的容差，避免真实碎片离子因为微小质量偏移无法匹配。可变修饰的设置需要权衡，过多可变修饰会显著增加数据库搜索空间，提升假阳性压力，还会降低匹配灵敏度；只保留研究目标关注的修饰。另外使用对应的参考序列数据库，不要使用冗余或者错误的序列库，避免真实肽段没有对应的理论谱图可以匹配。

需要区分，假阴性分为两种，一种是肽段在样品中存在，但仪器根本没有采集到它的二级谱，这是 DDA 最主要的假阴性，只能靠前端样品、色谱、采集参数改善；另一种是采集到二级谱，但搜库没有匹配上。前者只能通过实验采集环节优化，后者可以通过优化搜库参数改善。所有这些优化手段大多会带来一定代价，延长上机时间，或者小幅升高假阳性风险，因此需要同步把控 FDR，平衡假阴性与假阳性。