如何避免核酸交叉污染？

核酸污染主要来自三类来源：样本之间的交叉携带、过往的扩增产物气溶胶、耗材与台面器械残留核酸，污染之后 qPCR 出现 NTC 起峰、Ct 异常偏低、假阳性，RNA 还会同时伴随 RNase 降解问题，防控要覆盖样本前处理、核酸提取、配反应体系、扩增后全流程。

首先做好空间与流程顺序管控，这是最核心的一环。理想是三个功能区域分开，核酸提取区、qPCR 体系配制区、扩增产物处理区，流程单向流动，只能从提取到配体系再到产物区，绝对不允许扩增产物回到提取和配液区域。没有独立房间的实验室，采用时间隔离，先完成全部核酸提取，收好核酸样本，台面清洁完毕，再配制 qPCR 反应体系。PCR 仪、电泳设备不要放在核酸提取工作台附近，扩增结束的 PCR 管严禁在提取台开盖，产物管不要带回提取区域，扩增产物尽量不在实验室内开盖，直接密封丢弃。cDNA 属于扩增模板，逆转录之后的 cDNA 操作归入 qPCR 配液环节，不能回到原始 RNA 提取的工作台。

移液器、耗材是最容易被忽略的污染载体。所有接触核酸的枪头全部使用带滤芯枪头，阻断气溶胶进入移液器内部。移液器分区专用，提取一套枪，qPCR 配液一套枪，不要混用。移液器定期维护，当怀疑气溶胶进入枪体，需要拆解清洁或者紫外处理。离心管、PCR 管不要反复使用，全部一次性耗材。不要对着耗材管口说话、打喷嚏，尽量减少管子开盖暴露的时间。手套要勤更换，触碰过 PCR 管、扩增产物、电泳胶之后，立刻更换手套，不要继续处理原始样本与裂解样本。

操作行为上减少气溶胶产生。涡旋、剧烈吹打、高速离心后开盖，都会产生大量核酸气溶胶。样本涡旋尽量短暂，涡旋之后短暂离心再开盖。核酸提取、PCR 配液时开盖动作轻柔，不要快速弹开管盖。不要在工作台上方打开离心管、PCR 管的盖子，开盖朝向远离自己与其他样本。分装引物、酶、水这些 qPCR 组分，提前分装成小体积，避免反复吸取母液造成母液被污染。配 qPCR 体系遵循先加水、引物、酶，再加模板核酸的顺序，防止模板溅入预混母液。

台面和器械的清洁不能只靠 75% 乙醇，乙醇无法降解核酸。台面、超净台内壁、离心机转子、管架，定期使用核酸去除试剂擦拭，降解残留核酸。紫外照射可以降解裸露核酸，但对吸附在塑料缝隙、蛋白包裹的核酸效果有限，紫外只能作为辅助手段，不能当成防污染手段。超净台做完一类实验之后再开启紫外充分照射。离心机是污染重灾区，离心管偶尔破裂会释放大量核酸气溶胶，定期清理离心舱，一旦发生管破裂，立刻充分擦拭消杀，通风。

对照设置用来监控污染是否已经发生。每次 qPCR 必须设置无模板对照 NTC，同时设置提取空白对照，也就是全程和样本一起走提取流程，不加原始样本，监控提取试剂、环境、耗材引入的污染。一旦 NTC 或者提取空白出现扩增信号，说明环境已经存在核酸污染，需要暂停实验，消杀，排查污染源，不要继续上样本。

试剂管理也很关键。所有用于核酸实验的试剂分装小份保存，大瓶母液反复开盖吸取最容易被环境核酸污染。水、缓冲液、酶不要在 PCR 产物处理区开盖。RNA 相关实验，除了防 DNA 核酸污染，同时要防控 RNase，RNA 提取台不要摆放 PCR 产物、电泳产物。

样本处理环节，不同样本操作之间更换枪头，不要用同一根枪头接触多个样本。高拷贝样本和低拷贝样本尽量不要同一批处理，高浓度核酸样本的气溶胶极易污染低丰度样本。样本管盖子不要互相接触，管架定期清洁。

污染发生之后的处理，一旦确认环境存在扩增子污染，停止所有核酸提取和配 qPCR。全部台面、管架、离心机用核酸去除剂反复擦拭，通风，长时间紫外照射，更换全部枪头、离心管，移液器做清洁，确认 NTC 不再起峰再恢复实验。如果移液器内部已经被气溶胶污染，单纯擦拭无法解决，需要检修处理。