BCA 法测定总蛋白浓度时，需要注意哪些操作细节？

BCA 蛋白定量操作注意细节

试剂配制

BCA 工作液现配现用，A 液与 B 液严格按说明书比例混匀；B 液沉淀要完全溶解，避免局部铜离子分布不均，造成孔间误差。

标准品处理

BSA 标准品要充分混匀，梯度稀释操作准确，避免吹打产生气泡；标准品与待测样本要使用相同稀释液，保证基质一致，减少基质效应。空白孔稀释液和样本的溶剂保持一致，不能用水替代裂解液。

加样要点

加样避免产生气泡，气泡会直接拉高 OD 读数；尽量加到孔板底部，不要贴壁挂壁；标准品、空白、样本均设置复孔；条件允许标准品复孔分散排布，减轻 96 孔板边缘效应。边缘孔尽量补水，减少蒸发带来浓度虚高。

规避干扰物质

样本中高浓度 DTT、β‑巯基乙醇会造成结果严重偏高；高浓度 EDTA 螯合铜离子使结果偏低；甘油、糖类浓度过高也会干扰。若含有上述干扰物，可对样本进行稀释、透析或者换用 Bradford 法。

孵育条件严格统一

孵育温度、时间全部样本保持一致。温度偏低显色不足，OD 偏低；孵育时间过长会背景升高。常用 37 ℃孵育 30 min；孵育结束后冷却至室温再测 OD，温度变化会影响吸光度数值。

读板检测

检测波长 562 nm；孔板底部擦干净，避免指纹、水渍；去除孔内气泡再读数。复孔数值差异过大时，排查加样、气泡、蒸发问题，必要时剔除离群值。

样本本身

蛋白样本如果有沉淀，需要离心取上清再检测；避免核酸、细胞碎片残留干扰吸光值；样本浓度尽量落在标准曲线线性区间内，超出范围需要稀释后重新测定。

后续计算

注意带入样本稀释倍数；标准曲线 R² 尽量大于 0.99，低于 0.99 需要重新实验。