样本前处理的方法有哪些?

样本前处理核心目的：去除杂质、基质干扰、富集目标物、保护抗原 / 核酸 / 蛋白不降解，适配后续 ELISA、WB、qPCR、IHC、生化检测等实验，分为蛋白类样本（血清 / 血浆 / 组织 / 细胞）、核酸类样本、特殊基质样本三大类整理。

一、体液样本（血清、血浆、尿液、脑脊液、腹水、上清）

离心澄清

去除细胞碎片、沉淀颗粒，降低非特异吸附。血清 / 血浆常用 3000 g 10 min；尿液、细胞上清可提高至 8000–12000 g，必要时 0.22 μm 滤器过滤除菌除微粒。

蛋白保护与抑制降解

添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂（磷酸化蛋白检测）；低温操作，全程冰上，避免反复冻融。

去高丰度蛋白（血浆专用）

白蛋白、IgG 等高丰度蛋白会造成高背景，使用亲和层析柱去除，多用于低丰度靶标检测。

稀释 / 调 pH / 置换缓冲液

使用匹配缓冲液稀释样本，降低基质效应；超滤透析更换缓冲体系（去除小分子干扰物、盐分）。

沉淀去脂

高脂样本（脂血血清）：低温高速离心去除乳糜微粒，或有机溶剂轻度脱脂，避免脂质包裹抗原、堵塞固相载体。

二、组织样本（动物 / 人体新鲜组织、FFPE 石蜡组织）

新鲜组织

清洗：预冷 PBS 快速冲洗，去除血液、黏液、杂质。

破碎裂解

机械法：组织研磨仪、玻璃匀浆器、超声破碎

化学法：RIPA、NP-40 等裂解液提取总蛋白；Trizol 用于 RNA 提取

分层离心：裂解后离心取上清，弃沉淀（细胞碎片、细胞核残渣）

分装速冻：分装后液氮速冻，-80℃长期保存，避免反复冻融

FFPE 石蜡组织（IHC、蛋白 / 核酸提取）

脱蜡水化：二甲苯脱蜡→梯度乙醇复水至纯水

抗原修复（核心前处理，IHC 特有）

热修复：柠檬酸盐缓冲液 pH6.0、EDTA pH8.0/9.0，高压、水浴、微波加热

酶修复：胃蛋白酶、胰蛋白酶消化（适合部分胞外基质抗原）

灭活内源性干扰物：H₂O₂灭活内源性过氧化物酶；甘氨酸淬灭醛基交联

封闭非特异位点：BSA、血清封闭，减少抗体非特异结合

三、细胞样本（贴壁 / 悬浮细胞）

清洗：预冷 PBS 轻柔洗涤，去除培养基血清残留

收集：悬浮直接离心；贴壁可刮取或温和胰酶消化收集

裂解：根据实验选择非变性裂解液（CoIP、天然蛋白）或变性裂解液（WB）

离心澄清：去除不溶性细胞骨架沉淀，取上清

四、核酸专用前处理（qPCR、PCR）

裂解：蛋白酶 K、表面活性剂裂解细胞 / 组织，释放核酸

纯化：磁珠纯化、硅胶柱吸附，去除蛋白、多糖、酚类杂质

DNase/RNase 处理：去除基因组 DNA 污染或降解 RNA 杂质

浓缩 / 脱盐：乙醇沉淀、超滤，提升核酸浓度

五、其他特殊前处理技术

固相萃取 SPE：小分子多肽、代谢物，吸附目标物洗脱杂质，常用于 HPLC、LC-MS

超滤 / 透析：截留大分子蛋白，去除小分子干扰物、多余盐分，置换缓冲液

有机溶剂沉淀：丙酮、乙醇沉淀蛋白，去除脂质、小分子杂质（注意控制条件防止蛋白变性）

灭活处理：病原样本热灭活，保证生物安全（注意部分抗原不耐受热灭活）

匀浆脱脂、去色素：植物组织、肝脾等色素丰富样本，去除多酚、血红素干扰

六、通用质控配套操作

分装：小体积分装，避免反复冻融

低温管控：冰上操作，-20/-80℃保存

去除内源性干扰：胆红素、血红蛋白、脂类、蛋白酶、内源性生物素

补充：按实验选择侧重点

ELISA：重点 → 澄清离心、稀释、高脂处理、去除生物素干扰

WB：重点 → 充分裂解、蛋白酶抑制剂、离心去除不溶物

IHC（FFPE）：重点 → 脱蜡、抗原修复、灭活内源酶

CoIP：重点 → 非变性温和裂解，避免蛋白变性，预清除（pre-clear）去除杂蛋白