组织样本蛋白提取后如何进行 WB 分析？

组织蛋白提取完成后，已经得到裂解离心后的蛋白上清，首先完成 BCA 蛋白定量，分装‑80℃保存，尽量减少反复冻融，如果检测磷酸化蛋白，提取阶段就要加入蛋白酶与磷酸酶抑制剂。

先配制上样体系，组织样本常规每孔上样总蛋白 20‑40μg，低丰度靶蛋白可以提高到 40‑60μg，高丰度蛋白可以降低至 10‑20μg。根据 BCA 测出的浓度，吸取对应体积蛋白样本，加入 5×SDS 上样缓冲液，补水补齐体系。金属浴 95℃变性 5‑10 分钟，磷酸化蛋白不要长时间煮沸，避免磷酸基团丢失。变性结束瞬时离心，只取上清使用，如果样本粘稠，说明基因组 DNA 释放，冰上短暂超声打碎 DNA，防止电泳堵孔，底部沉淀舍弃不要上样。

接下来进行 SDS‑PAGE 电泳，依据靶蛋白分子量选择胶的分离胶浓度，大分子量蛋白选用低浓度胶，小分子量蛋白选用高浓度胶。组装电泳槽，倒入电泳缓冲液，拔掉梳子，冲洗胶孔内残留碎胶。依次上蛋白 Marker 和各组样本，空余泳道用上样缓冲液补齐，避免泳道偏移。浓缩胶阶段设置恒压 80V，待溴酚蓝压成一条细线进入分离胶后，调整电压至 100‑120V，直到溴酚蓝跑至胶底部结束电泳。

转膜优先选用湿转，更适合杂质较多的组织样本。PVDF 膜用甲醇活化十几秒，海绵、滤纸、凝胶全部浸泡在预冷转膜缓冲液。按照海绵‑滤纸‑凝胶‑PVDF 膜‑滤纸‑海绵的顺序摆放，每一层都要排尽气泡，胶朝向负极，膜朝向正极。转膜槽放置冰盒降温，300mA 转 90‑120 分钟，大分子蛋白适当延长时间，小分子蛋白注意防止转膜过度。

转膜结束取出 PVDF 膜，TBST 简单漂洗。封闭液选择上，普通总蛋白可用 5% 脱脂奶粉 TBST，检测磷酸化蛋白必须使用 5% BSA‑TBST，牛奶中含有磷酸蛋白会造成高背景。室温封闭 1‑2 小时，也可以 4℃封闭过夜。

一抗按照说明书用封闭液稀释，膜完全浸没在抗体溶液中，4℃摇床过夜孵育。孵育完成 TBST 洗涤，每次 5‑8 分钟，一共洗 3‑4 次。之后加入 HRP 标记二抗，封闭液稀释，室温摇床孵育 1‑1.5 小时，再次 TBST 洗涤 3‑4 次，充分洗去未结合二抗，降低背景。

发光显影，ECL 发光液 A、B 等体积混匀，将膜蛋白面朝上，均匀覆盖发光液，室温孵育 1‑3 分钟，化学发光成像仪采集图像，选择合适曝光时间，保存原始图片。如果一张膜需要检测多个蛋白，可以进行 stripping 洗膜再孵育，组织样本条件允许建议分开跑膜，减少 stripping 带来的信号损失。

数据分析使用 ImageJ 读取条带灰度，靶蛋白灰度值除以对应泳道内参灰度，得到蛋白相对表达量。组织样本注意，GAPDH 在损伤、肿瘤组织表达会发生波动，优先选用 β‑actin、Tubulin，用两个内参互相校验。

组织样本做 WB 常见问题，蛋白降解会出现大量弥散小分子杂带，需要组织离体快速冻存，提取全程冰上，添加抑制剂，避免反复冻融。上样孔出现沉淀，多为 DNA 或者组织残渣，变性后只取上清，粘稠样本做短时间超声。高背景大多来自封闭不充分、二抗浓度过高、洗膜不充分，磷酸化检测误用牛奶封闭也会背景很高。无条带需要排查蛋白降解、转膜方向颠倒、一抗不适配变性抗原、上样量不足。泳道条带歪斜偏移，多是空孔没有补齐缓冲液，胶孔残留碎胶。