组织样本蛋白提取的具体步骤是什么？

适用：动物 / 人新鲜或液氮冻存组织，总蛋白组、修饰组（磷酸化 / 泛素化等），裂解液选用 4% SDS‑Tris 体系，全程冰上低温操作。

1. 样本准备

若是‑80℃冻存组织，取出冻存管，放在冰上，不要完全融化，保持半冻坚硬状态。称重，取 20‑100mg 组织。新鲜组织漂洗吸干后直接冰上称重。

组织表面必须吸干 PBS，残留 PBS 会稀释裂解液。

2. 组织破碎

根据组织质地选择破碎方式。

软组织（肝、肾、脑、肿瘤）：组织放入研磨管，加入预冷陶瓷研磨珠，先加裂解液再上研磨仪。

硬 / 纤维丰富组织（心脏、骨骼肌、纤维化肿瘤）：液氮预冷研钵，把组织置于液氮下研磨成细腻粉末，粉末不要融化，快速转移到预冷裂解液中。

裂解液配方：4% SDS，100 mM Tris‑HCl pH7.6。总蛋白组加入蛋白酶抑制剂；修饰组同时加入蛋白酶抑制剂 + 磷酸酶抑制剂。

比例：每 1mg 组织加入 5‑10 μL 裂解液。

3. 裂解与超声助溶

研磨完成后将样本置于冰上。超声采用短脉冲模式，低功率，超声几秒，间歇冷却，反复循环，全程冰浴，严禁产热升温。超声目的打碎细胞、基因组 DNA，不要过度超声。

超声结束，冰上静置 15‑30 min，充分蛋白溶解。

4. 高速离心取蛋白上清

4℃，12000‑14000 g，离心 20‑30 min。离心后管底是细胞碎片沉淀，脂肪组织上层会出现油脂层。小心吸取中间清亮上清，不要吸到底部沉淀，也不要吸取上层浮油。丢弃沉淀与油脂。

5. 蛋白定量

取部分上清，使用 BCA 试剂盒定量。空白用同款裂解液，不能用水；标准品也用裂解液稀释，保证基质匹配。样本视浓度做稀释，使读数落在标准曲线线性区间，设置 2 个技术复孔。得到蛋白浓度 μg/μL。

6. 蛋白完整性质控（可选但推荐）

取等量蛋白进行 SDS‑PAGE 电泳，观察条带。条带弥散严重提示蛋白降解；同时可以观察白蛋白条带，辅助判断血浆污染。

7. 质谱前处理衔接

吸取需要的蛋白量（一般 50‑100 μg 用于蛋白组）。SDS 体系样本需要去除 SDS，可采用 FASP 法或者丙酮沉淀；之后进行 DTT 还原、IAA 烷基化，再做胰蛋白酶酶解。

如果用 8M 尿素裂解液，裂解完成后稀释尿素浓度至 2M 以下，再进行还原烷基化、酶解。

关键注意要点

修饰组样本从取材漂洗到裂解全程尽量缩短时间，所有操作冰上进行，防止修饰位点丢失。

冻存组织一旦完全融化，内源蛋白酶快速激活，极易降解。

超声过热是蛋白变性、交联的主要原因，宁可少超声，不要大功率长时间超声。

不要重悬沉淀再次提取，沉淀代表破碎不足，需要优化破碎手段。

上清如果暂时不做后续实验，可以分装‑80℃保存，避免反复冻融。

方法学描述参考

组织经 4℃预冷无钙镁 PBS 快速漂洗，滤纸吸干表面液体，液氮速冻后‑80℃保存。蛋白提取时，样本冰上半冻状态称重，液氮研磨为组织粉末，加入含蛋白酶（及磷酸酶）抑制剂的 4% SDS 裂解液，冰上超声辅助裂解；4℃ 13000 g 离心，收集上清，BCA 法测定蛋白浓度，随后采用 FASP 去除 SDS，进行还原烷基化与胰蛋白酶解。