细胞培养24孔板可以提取RNA做PCR吗？

24 孔板完全可以提取细胞 RNA 做 qPCR，是很常用的体系，但是细胞量偏少，要注意细节，避免 RNA 降解、得率不足。

首先看细胞数量，24 孔板单孔长满的细胞数量大概在 2×10⁵‑5×10⁵，不同细胞系有差异。普通贴壁细胞，汇合度 70‑90% 的时候，一孔的总 RNA 一般可以得到 1‑4 μg，足够做反转录，反转之后的 cDNA 可以做多对引物 qPCR。如果细胞长得稀，比如 30‑40% 汇合度，RNA 产量会很低，有可能出现浓度测不到，qPCR 扩增 Ct 值整体偏大。

收样操作上，不用消化收集细胞，直接吸掉培养基，预冷 PBS 快速漂洗一次，尽量吸干净 PBS，直接往孔内加入 RNA 提取裂解液，常温裂解数分钟，吹打充分，把裂解液全部收集到离心管，后续按照 RNA 提取流程操作。漂洗 PBS 不要反复冲洗，操作动作要快，防止细胞脱落同时避免 RNA 降解。不要留培养基残留，培养基里面的盐、血清成分会干扰裂解。

RNA 质量控制，24 孔样本 RNA 总量少，不建议用分光光度计裸测，低浓度时 A260/A280 容易失真，优先用 Nanodrop 参考，有条件用琼脂糖电泳或者毛细管电泳看完整性。如果 RNA 浓度很低，可以适当减少洗脱体积，比如洗脱用 20‑30 μL，提高 RNA 终浓度。

反转录环节，得到的 RNA 总量有限，不要把全部 RNA 都用完，尽量保证反转录的 RNA 投入量在 200‑1000 ng。如果 RNA 不足，就整孔全部拿来反转，不建议过分浓缩，浓缩过程容易损失 RNA。

需要注意的问题，，24 孔单孔 RNA 产量有限，不适合做大量基因的 qPCR 筛选，基因数量多建议提高孔板规格，用 12 孔或者 6 孔。第二，样本处理全程避免 RNA 酶污染，裂解之后的样本可以‑80℃长期保存。第三，生物学重复要以独立的孔为单位，同一个 24 孔板不同孔可以作为生物学重复，但是要注意板间差异。第四，如果处理之后细胞死亡脱落多，弃培养基的时候不要倒掉悬浮细胞，需要离心收集悬浮细胞，再加入裂解液，不然会丢失大部分 RNA。

另外，24 孔板也可以直接做细胞裂解一步法反转录 qPCR，省去 RNA 纯化步骤，适合样本量极低的情况，但缺点是残留基因组 DNA、杂质干扰，对引物要求高，需要做 gDNA 去除处理。

简单总结，24 孔板可以提取 RNA 做 PCR，适合少量基因检测，核心把控细胞汇合度，保证 RNA 得率，做好 RNase 防控，低浓度 RNA 注意质控。如果本身细胞增殖慢、细胞个头小，建议优先选用 12 孔板提升 RNA 产量。