如何提高脂肪细胞提取RNA和蛋白质的效率？

提高脂肪细胞 RNA 与蛋白提取效率的实操方法

一、细胞收集阶段提升得率

充分去除外源油脂

弃培养基后用预冷 PBS 反复冲洗细胞两次，冲掉血清脂类；贴壁细胞尽量低温快速刮取，不使用胰酶长时间消化，避免脂滴破碎游离油脂增多。收集细胞离心后，仔细吸净上层漂浮油膜与管壁附着油脂，从源头减少脂质干扰，防止脂类包裹核酸、蛋白造成释放不足。

适当增加细胞投入量

成熟脂肪细胞绝大部分体积为脂滴，胞质基质占比极低，同等细胞数核酸、蛋白远少于普通细胞。常规可将细胞投入量提升至常规成纤维细胞的 1.5～2 倍，弥补基质含量不足带来的低产量问题。

二、裂解环节强化释放效率

充分破碎脂滴是核心

加入裂解液后持续强力吹打数十次，将大块脂滴打散成微小油珠，消除脂滴包裹屏障，让裂解液充分接触胞内 RNA 与蛋白；裂解过程每隔 5 分钟重复吹打一次，全程冰上裂解，延长裂解时长至 30 分钟，充分释放胞内大分子。

选用适配高脂样本的裂解试剂

提取 RNA 优先使用 QIAzol，相比普通 Trizol 对脂类溶解、分层效果更好；提取蛋白选用含 SDS 与脱氧胆酸钠的完整 RIPA，强去污剂能穿透脂滴膜，温和无 SDS 裂解液会大幅降低蛋白回收效率，不建议使用。

抑制剂现配现加

蛋白提取时新鲜添加蛋白酶、磷酸酶抑制剂，避免裂解过程中蛋白降解丢失；RNA 提取全程无酶耗材，减少核酸降解损耗。

三、分层脱脂优化，减少目标分子损失

低温高转速长时间离心分层

分层、蛋白裂解后离心统一采用 4℃、12000g 以上转速，离心时长延长至 15～20 分钟，保证油脂完全上浮形成完整油层，油水清晰分离，避免乳化。一旦发生乳化，可低温静置 10 分钟再次离心分层。

分层后优先去除表层浮油

RNA 提取分层后，先用枪头刮除全部上层白色脂层，再更换新枪头吸取水相；蛋白上清吸取前完整吸除顶层油膜，必要时吸取上清后再次离心二次脱脂，防止脂质携带核酸、蛋白一同被丢弃，同时避免脂质杂质抑制后续反应。

四、RNA 提取专属增效手段

优化沉淀条件提升微量 RNA 回收

异丙醇沉淀时加入少量糖原，辅助低浓度 RNA 形成可见沉淀；-20℃沉淀 30 分钟以上，低温促进核酸充分沉降，减少游离 RNA 留在上清中流失。

加强洗涤去除脂类干扰

75% 无酶乙醇洗涤操作重复两次，充分洗脱结合在核酸上的脂类、酚盐杂质，避免脂质抑制逆转录，同时保证 RNA 沉淀纯度，提升有效可用 RNA 量。

温和溶解防止降解

晾干沉淀时不要完全干透，加入无酶水后 55℃短时水浴助溶，提升 RNA 溶解效率，避免沉淀结块无法充分溶出造成表观产量偏低。

五、蛋白提取专属增效手段

二次脱脂减少杂质损耗

初次离心吸取上清后再次高速离心 10 分钟，除去溶解在蛋白液中的微量脂质，避免脂类干扰 BCA 定量，同时防止电泳时蛋白随脂类弥散丢失。

蛋白沉淀充分溶解

若采用 Trizol 同步提取蛋白，盐酸胍乙醇洗涤步骤不可省略，去除酚与脂残留；蛋白沉淀使用含 SDS 的缓冲液 50℃水浴溶解，脂质包裹的蛋白才能充分溶出，提升蛋白定量浓度。

六、同步提取 RNA + 蛋白增效要点

分层操作快速完成，不要长时间室温放置，防止脂类扩散进入水相带走 RNA；取水相动作轻柔，避免搅动中间蛋白层造成交叉损耗。

分离有机相后及时沉淀蛋白，不要长时间存放，减少蛋白吸附在管壁、脂滴表面造成损失。

七、通用损耗控制要点

全程低温操作，室温放置会加速核酸降解、蛋白水解，降低有效产物量。

操作时不反复吹打产生大量泡沫，泡沫会吸附核酸与蛋白，随废液丢弃造成损耗。

提取完成后立即分装冻存，避免反复冻融导致大分子断裂降解，减少有效样本损失。