脂肪细胞提取RNA和蛋白质的注意事项

脂肪细胞同步 / 分开提取 RNA、蛋白通用注意事项

一、细胞收集阶段

成熟脂肪细胞内含大量脂滴，离心后油脂会上浮包裹细胞沉淀，弃培养基和 PBS 清洗液时，务必把上层漂浮油膜完全吸净，管壁附着的油滴也要吸干，油脂残留会持续污染后续核酸与蛋白。

全程低温操作，细胞收集、裂解、离心均置于冰上，室温放置会让脂滴破裂扩散，脂质氧化结合 RNA 和蛋白，造成降解、纯度下降。

清洗细胞只用预冷无血清 PBS，血清自带脂质会加重脂污染，清洗至少两次。

二、RNA 提取专属注意事项

分层离心后步先刮除表层白色脂肪层，再吸取水相，油脂一旦混入水相，会造成 A260/230 显著降低，抑制后续逆转录和 qPCR 扩增。

75% 乙醇洗涤步骤需要重复两次，普通细胞单次洗涤不足以去除结合在核酸上的脂类、酚残留，洗涤后充分去除乙醇，避免残留乙醇抑制酶反应。

沉淀 RNA 时可加入糖原提升回收率，成熟脂肪细胞胞质少，同等细胞数量 RNA 产量远低于普通细胞，容易出现微量沉淀难以肉眼观察。

晾干 RNA 沉淀不能完全干透，过度干燥会导致 RNA 极难溶解，溶解时可短时水浴加热辅助溶出。

全程使用无酶枪头、无离心管，脂滴破裂释放的杂质会加速 RNA 降解，裂解后尽快分层提取，不要长时间静置。

三、蛋白提取专属注意事项

RIPA 裂解液临用前现加蛋白酶、磷酸酶抑制剂，脂肪细胞代谢蛋白丰富，室温或无抑制剂条件下极易发生蛋白降解、磷酸化修饰丢失。

裂解时每隔几分钟反复吹打，把聚集的大脂滴充分打碎，脂滴包裹会阻碍裂解液渗透，大幅降低蛋白提取产量。

必须采用高转速、长时间低温离心分层，离心后分层清晰，先吸除顶层全部油脂，再更换枪头吸取中间蛋白上清，绝对不能吸到油层和底部细胞碎片。

一次脱脂不可重复一次离心脱脂，微量脂质混入蛋白上清会造成 BCA 定量数值虚高，WB 电泳出现弥散条带、背景脏污。

蛋白沉淀溶解优先选用含 SDS 的溶解液，单纯缓冲液难以溶解被脂质包裹的蛋白，溶解后尽快分装冻存，避免反复冻融。

四、Trizol 同步分提 RNA + 蛋白特有注意事项

分层后先除浮油再取水相，下层有机相存放时避免温度回升，防止脂类重新溶入水相。

从有机相沉淀蛋白时，盐酸胍乙醇洗涤步骤不可省略，专门去除酚、脂类杂质，否则蛋白纯度差，无法用于 WB。

同步提取不要延长裂解静置时间，长时间室温放置会让脂类均匀分布在两相，大幅增加脱脂难度。

五、通用质控与保存注意事项

RNA 质控标准：A260/280 在 1.9~2.1，A260/230 大于 1.8，若比值偏低代表脂 / 酚污染，需要重新乙醇洗涤纯化。

蛋白定量后尽快分装，避免大体积反复冻融，变性后的蛋白样品可短期 - 20℃存放，未变性蛋白长期保存置于 - 80℃。

所有含油脂废液单独吸取丢弃，不要直接混入样本管，操作中枪头接触油层后直接更换，不重复使用。

避免剧烈震荡导致脂滴乳化，乳化后油水无法分层，核酸蛋白完全被脂质包裹，样本直接报废。