细胞传代后支原体PCR检测的样本制备过程是怎样的?

细胞支原体 PCR 样本制备完整流程（传代后细胞上清样本）

分两种常用方案：简易热裂解法（快速筛查）、柱式 DNA 提取法（高灵敏度，弱阳性 / 珍贵细胞），均为传代后细胞取样操作。

一、取样步骤（传代后统一操作）

传代培养 24～48 h 后取样，此时支原体大量释放到培养液上清，检出率最高；刚传代密度极低也可直接取培养液。

超净台内用无菌滤芯吸头吸取培养瓶上清 100～200 μL，转移至无酶 PCR 离心管。

每更换一株细胞必须换新吸头，避免交叉污染造成假阳性；做好样本编号区分。

短期检测可 4℃存放 1～2 天，长期待检测分装后 - 20℃冻存，减少反复冻融。

同步准备对照样本：未培养细胞的空白完全培养基，用于排除血清、培养基本身污染。

二、方案 1：热裂解法（大批量常规筛查，无需试剂盒）

适合日常月度批量检测，操作快，成本低。

吸取 50 μL 细胞上清加入无酶 PCR 管；

金属浴 / PCR 仪设置 95℃，加热裂解 10 min，高温裂解支原体细胞膜，释放内部 DNA，同时灭活上清内核酸酶、蛋白抑制物；

裂解结束后瞬时离心 30 秒，管壁液体甩至管底；

冷却至室温，取 2 μL 上清直接作为 PCR 扩增模板，剩余样本可丢弃。

缺点：上清中血清、酚红存在少量 PCR 抑制剂，极低支原体载量样本容易漏检。

三、方案 2：柱提法（纯化 DNA，疑似污染、低载量样本）

去除培养基中蛋白、色素等抑制物，灵敏度显著提升，确诊弱阳性时使用。

取 200 μL 细胞上清放入无酶 1.5 mL 离心管；

按照核酸提取试剂盒说明书加入裂解液与蛋白酶 K，充分吹打混匀，室温或 56℃水浴裂解 10～15 min，破碎支原体；

加入结合液混匀，转移至核酸吸附柱，低速离心使 DNA 结合在硅胶膜上；

分两次加入洗涤液离心漂洗，去除蛋白、酚红、盐离子等 PCR 抑制杂质；

空柱高速离心 1 min，去除残留乙醇（乙醇会抑制 Taq 酶，造成无扩增条带）；

向吸附柱膜中心加入 30～50 μL 无酶洗脱水，室温静置 2 min，离心收集洗脱 DNA；

洗脱后的 DNA 液体即为模板，可直接用于 PCR，剩余 DNA-20℃保存备用。

四、样本制备关键注意事项

全程使用无酶离心管、滤芯吸头，操作台提前紫外消毒，防止环境 DNA 污染；

不要取细胞沉淀代替上清，支原体多数游离在培养液中，仅取细胞容易漏检；

若细胞长期添加支原体清除类抗生素，需停药连续传 3 代再取样，否则支原体载量过低出现假阴性；

操作污染阳性样本时单独处理，不和正常细胞样本同步制备，避免气溶胶扩散污染其他模板；

所有样本、耗材一次性使用，不重复回收离心管与吸头。