如何判断细胞培养瓶内的细胞是否需要传代？

判断细胞是否需要传代，主要依据四点：细胞汇合度、细胞形态、培养液颜色、生长状态，优先以汇合度作为主要标准。

1. 倒置显微镜观察细胞汇合度（最核心标准）

最佳传代时机：细胞铺满培养瓶瓶底80%‑90%，细胞之间相互接触，但还没有层层堆叠。细胞依旧呈独立形态，间隙清晰，处于对数生长期，活力，消化后适合传代或者铺细胞爬片。

错过最佳时间：汇合度达到 100%（完全铺满瓶壁）。细胞紧密相连，发生接触抑制，增殖停滞，容易出现上皮‑间质转化（EMT）、蛋白表达异常。后续用来做造模、免疫荧光实验重复性差。

绝对禁止：细胞多层堆叠、成团，这种细胞不建议用于功能实验。

2. 细胞形态判断

正常待传代细胞：形态规整（上皮细胞呈多边形、成纤维细胞呈梭形），轮廓舒展，无大量漂浮圆型死细胞。

若细胞出现拉长、蜷缩、重叠挤压，说明已经长满，必须立刻传代。

3. 培养基颜色变化（肉眼初步判断）

培养基里含有酚红指示剂：

正常培养基为橘红色；

细胞代谢消耗葡萄糖，产生乳酸，培养液快速变黄，代表细胞密度已经很高，营养被大量消耗，短时间内就要传代；

培养液如果在 24 h 内就明显发黄，说明细胞密度已经接近 90%，需要尽快传代。

注意：培养液浑浊发黄同时伴随絮状物，属于微生物污染，不能再传代。

4. 生长周期辅助判断

传代后前 24 h：细胞贴壁阶段，增殖慢，一般不用传代；

2‑4 d 进入对数增殖期，在此期间密切监测汇合度。

肾小管上皮细胞（mCCD‑cl1、HK‑2）生长偏慢，一般 3‑4 d 左右达到传代标准；肿瘤细胞 2‑3 d 即可达到传代条件。

5. 额外禁忌判断（该细胞不能再传代）

出现下面情况，细胞舍弃，不能继续传代：

死细胞数量＞5%；

细胞形态发生畸变、老化，胞内空泡变多；

存在细菌、真菌污染；

永生化细胞传代超过 30 代，表型不稳定。

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倒置显微镜下观察细胞汇合度，当细胞生长至 80%‑90%、处于对数生长期时进行传代。同时结合培养基颜色进行辅助判断，培养液快速变黄提示细胞代谢旺盛，应及时传代；避免细胞完全铺满瓶底后因接触抑制发生表型改变。若细胞出现老化、大量凋亡或污染，则不再进行传代培养。

总结口诀

看汇合度（80%‑90% 优先）→看细胞形态→看培养基颜色，三者结合确定传代时间。