细胞培养瓶内的细胞传代后，换液时需要注意哪些事项？

细胞传代后换液注意事项

一、换液前准备

提前将完全培养基、无菌 PBS 放至 37 ℃水浴预热，冷培养液会刺激细胞，引发细胞应激、收缩、凋亡，还会延缓贴壁。

超净台提前紫外消毒 30 min，75% 酒精擦拭台面；培养瓶外壁用 75% 酒精擦拭后再移入超净台，防止外源污染物带入。

移液枪、吸头提前灭菌，全程无菌操作。

二、吸弃旧培养基环节

移液枪枪头贴着培养瓶侧壁吸取废液，枪头不能触碰瓶底贴壁的细胞层，防止刮伤细胞。

不要将培养液完全吸干后长时间空瓶放置，细胞直接暴露在空气里容易脱水受损，吸完废液要尽快加新培养基。

换液时，培养液里漂浮大量死细胞，尽量把旧培养基全部吸除；若死细胞很多，可使用无菌 PBS 沿瓶壁轻柔漂洗 1 次，再吸弃，去除漂浮凋亡细胞、胰酶残留、代谢废物。上皮细胞贴壁较脆弱，PBS 冲洗动作一定要轻。

三、添加新培养基环节

新鲜培养基沿着培养瓶侧壁缓慢注入，禁止直接冲击瓶底细胞，剪切力会造成细胞脱落。

培养基添加量要适宜，T25 培养瓶一般加 4‑5 mL 完全培养基；液体过少营养不足、易蒸发；培养液过多，瓶内氧气交换变差，细胞代谢受抑制。

加完培养液后，水平轻轻晃动培养瓶，使培养基均匀铺满瓶底，不要大幅度摇晃。

四、放回孵箱及后续细节

拧紧瓶盖后再回旋半圈，保持通气状态，保证 5% CO₂进入培养瓶，稳定培养基 pH；瓶盖拧死会造成培养液碱化，细胞生长变慢。

再次用 75% 酒精擦拭瓶身外壁，放入恒温培养箱。

控制换液频率：传代后换液 24 h；后续常规每 2‑3 d 换液。若培养基快速变黄，代表细胞增殖快、代谢废物多，要缩短换液间隔。

五、针对后续细胞爬片实验的额外注意点

用于铺爬片的对数生长期细胞，换液尽量不要用 PBS 反复冲洗，避免细胞应激，造成后续铺爬片后贴壁能力下降。

尽量减少不必要的换液次数，每一次开盖操作都会增加污染风险。

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换液前将完全培养基置于 37 ℃水浴预热，在无菌超净台中进行操作。吸弃旧培养基时枪头沿培养瓶侧壁吸取，避免刮擦贴壁细胞；必要时用无菌 PBS 轻柔漂洗去除悬浮死细胞。沿瓶壁缓慢加入预热后的新鲜完全培养基，水平轻晃培养瓶。培养瓶瓶盖半旋松保证气体交换，外壁经 75% 乙醇消毒后放回 37 ℃、5% CO₂恒温孵箱培养。