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Advanced DNA RNA 转染试剂在 RAW264.7、THP-1 细胞中的高效应用

—— 先天免疫 lncRNA 与 miRNA 功能研究实践

一、文献基础与ZETA life 转染试剂应用背景

本内容基于发表于免疫领域权威期刊《Frontiers in Immunology》的前沿研究成果展开，文献 DOI：10.3389/fimmu.2020.581517。文章系统验证了 ZETA life 公司 Advanced DNA RNA 转染试剂（货号：AD600150）在巨噬细胞先天免疫机制研究中的应用优势。该试剂可同步完成质粒、siRNA、miRNA 模拟物 / 抑制剂的高效细胞递送，完全适配 lncRNA、miRNA 介导的 ceRNA 调控通路相关全套功能验证实验，是单核 / 巨噬细胞非编码 RNA 研究的理想转染工具。

二、试剂应用体系：靶细胞、转染底物与标准化操作方案

（一）实验靶细胞

RAW 264.7：经典小鼠巨噬细胞系，多用于小鼠源 lncRNA 初步功能探究；

THP-1：人单核细胞细胞株，经 PMA 诱导分化为人巨噬细胞，用于人源同源非编码 RNA 功能验证，更贴合人体先天免疫研究场景。

（二）各类转染核酸底物及实验用途

过表达质粒（1）Gm28309 过表达质粒（Gm28309 (+)）：用于上调 lncRNA Gm28309 表达，开展功能获得型实验；（2）pGL3 荧光素酶报告质粒：构建携带 Gm28309 野生型（WT）、突变型（Mut）片段，以及 kB-Ras2 mRNA 3'UTR 野生 / 突变序列的重组载体，为 ceRNA 分子相互作用验证提供双荧光素酶报告检测体系。

siRNA 干扰片段构建靶向 P3852、P33714 等 6 种候选 lncRNA 的特异性 siRNA，用于 lncRNA 敲低实验（功能缺失验证），全部 siRNA 序列详见原文补充附表 Supplementary Table 1。

miRNA 功能调控试剂（1）miR-3068-5p mimic：外源导入模拟 miRNA，提升细胞内 miR-3068-5p 水平，模拟其内源生物学功能；（2）miR-3068-5p inhibitor：特异性拮抗细胞内成熟 miR-3068-5p，阻断其对下游靶基因的抑制作用。

（三）标准化转染操作流程

实验采用ZETA life Advanced DNA RNA 转染试剂，将转染试剂与质粒或 siRNA 核酸按照 1:1 体积比例充分混匀，制备转染复合物后加入细胞培养体系；转染孵育 24 h 后收集细胞上清与细胞沉淀，开展炎症因子检测、蛋白免疫印迹、荧光素酶活性检测、胞内活菌计数等分子与细胞水平检测，完整操作细则参照原文 Materials and Methods 章节。

三、依托该转染体系获得的核心实验结论

借助该高效转染方案，本研究完整阐明lncRNA Gm28309 在布鲁氏菌感染诱导巨噬细胞炎症应答中的调控通路，核心结论分为三大板块：

1. lncRNA 调控 NLRP3 炎症小体与巨噬细胞抗感染免疫

（1）敲低人源同源 lncRNA P33714 后，巨噬细胞 IL-1β、IL-18 炎症因子分泌量显著上升，同时可显著抑制布鲁氏菌在细胞内的存活与增殖（原文图 3）；（2）过表达小鼠 lncRNA Gm28309 能够显著抑制 NLRP3 炎症小体活化，下调 NF-κB 通路 p65 蛋白磷酸化水平，减少 IL-1β、IL-18 释放，进而促进布鲁氏菌实现胞内免疫逃逸（原文图 4）。

2. ceRNA 分子互作机制验证

lncRNA Gm28309 具备内源 miRNA 海绵（ceRNA）功能，可特异性吸附结合 miR-3068-5p，解除 miR-3068-5p 对靶基因 kB-Ras2 的转录后抑制，进而调控下游 NF-κB 炎症信号通路，最终改变巨噬细胞抗感染炎症反应强度；双荧光素酶报告实验直接证实 Gm28309 与 miR-3068-5p 存在特异性直接结合关系（原文图 5C、5D）。

3. miR-3068-5p/NF-κB 通路功能回补验证

抑制miR-3068-5p 表达，或使用 NF-κB 通路特异性抑制剂 JSH-23 阻断 p65 活化，均可明显减弱 NLRP3 炎症小体激活程度，提升胞内布鲁氏菌存活数量。该结果反向印证 Gm28309/miR-3068-5p/kB-Ras2/NF-κB 信号轴是调控布鲁氏菌感染先天免疫的核心通路（原文图 6）。

四、研究学术价值

本研究以ZETA life Advanced DNA RNA 转染试剂为核心实验工具，在 RAW264.7 小鼠巨噬细胞、PMA 诱导分化 THP-1 人巨噬细胞两套模型中，完整完成 lncRNA-miRNA ceRNA 调控网络的功能与机制验证。研究揭示 lncRNA Gm28309 介导布鲁氏菌免疫逃逸的分子通路，为胞内菌感染性疾病的先天免疫调控研究提供分子靶点与标准化细胞实验范式，相关成果已发表于国际知名免疫学期刊《Frontiers in Immunology》。