化学法制备感受态细胞的具体步骤是什么?

化学法（CaCl₂法）制备感受态细胞完整操作步骤

化学法制备感受态细胞的经典准方案为氯化钙（CaCl₂）法，操作简便、重复性强，常规转化效率可达 1×10⁷~1×10⁸ CFU/μg，完全满足常规质粒转化、基因克隆构建等绝大多数分子生物学实验需求。全程操作必须严格遵循无菌原则 + 全程低温控制两大核心要求，这是决定感受态细胞质量与转化效率的关键。

一、实验前准备

1. 无菌耗材与设备预处理

所有接触菌体的耗材均需无菌处理，1.5mL EP 管、50mL 离心管、10mL 移液管、三角摇瓶、涂布棒、LB 平板等耗材，全部经 121℃高压灭菌 20min 后烘干备用。超净台、高速冷冻离心机、恒温摇床、恒温水浴锅需提前 30min 开启紫外消毒；离心机需提前预冷至 4℃，所有后续接触菌体的耗材，使用前均需全程冰浴预冷，杜绝室温接触。

2. 试剂配制

所有试剂均使用 18.2MΩ・cm 的超纯水配制，全程无菌操作。

LB 液体培养基：称取胰蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，用超纯水定容至 1L，调节 pH 至 7.0，经 121℃高压灭菌 20min 后，4℃密封保存。

LB 固体培养基：在 LB 液体培养基的配方基础上，加入 15g/L 的琼脂粉，同条件高压灭菌后，在超净台内倒制平板，4℃避光密封保存。

SOC 复苏培养基（可选，复苏效果优于 LB，可提升转化效率）：称取胰蛋白胨 20g、酵母提取物 5g、NaCl 0.5g，加入终浓度 2.5mmol/L 的 KCl、10mmol/L 的 MgCl₂、20mmol/L 的葡萄糖，超纯水定容至 1L，调节 pH 至 7.0，经 0.22μm 滤膜过滤除菌，4℃密封保存。

0.1mol/L CaCl₂核心溶液：称取无水 CaCl₂ 11.1g，超纯水定容至 1L，经 0.22μm 滤膜过滤除菌或 121℃高压灭菌，4℃预冷保存，使用前必须提前冰浴降温。

感受态冻存液：在 0.1mol/L CaCl₂溶液中，加入终浓度 15%（v/v）的无菌甘油，经 0.22μm 滤膜过滤除菌，4℃预冷保存。

质控用试剂：浓度 10pg/μL 的 pUC19 超螺旋标准质粒、100mg/mL 的氨苄青霉素（Amp）母液，分装后 - 20℃避光冻存，避免反复冻融。

3. 合格菌种准备

必须使用 - 80℃甘油保藏的原代大肠杆菌菌种（常用菌株包括 DH5α、TOP10、JM109、BL21 (DE3) 等），严禁使用多次传代、4℃长期存放、室温放置过久的老化菌种，此类菌种易出现活力下降、抗性突变，无法制备出高活性的感受态细胞。

二、标准 CaCl₂法完整操作步骤

阶段：菌种活化（保证菌体均一高活力）

一级平板活化：在超净台内，将 - 80℃保存的甘油菌置于冰上缓慢融化，用无菌接种环蘸取少量菌液，在无抗 LB 固体平板上进行三区划线。划线完成后，平板倒置放入 37℃恒温培养箱，培养 12~16h，直至长出直径 2~3mm、圆润光滑、边缘整齐、大小均一的单菌落，且无杂菌污染。此步骤需注意，平板传代次数不可超过 3 次，培养时间不可超过 20h，避免菌落老化失活。

二级种子液制备：在超净台内，用无菌枪头挑取 1 个形态饱满、均一的单菌落，接种至 5mL 无抗 LB 液体培养基中，置于 37℃恒温摇床，200~220rpm 振荡培养 12~14h（过夜培养），至菌液均匀浑浊，OD₆₀₀值达到 1.0~1.2，获得饱和种子液。此步骤严禁挑取菌落边缘的卫星菌落，避免菌种不纯。

第二阶段：扩大培养与收菌（决定转化效率的核心环节）

扩大培养，控制菌体对数生长期：按照 1:50~1:100 的接种比例，将过夜培养的种子液接种至提前预热至 37℃的 100mL 无抗 LB 液体培养基中，使用 250mL 三角摇瓶，装液量不可超过摇瓶体积的 1/5，保证菌体培养过程中有充足的通气量。接种后置于 37℃恒温摇床，200rpm 振荡培养，每 20~30min 取样一次，检测菌液的 OD₆₀₀值。当 OD₆₀₀值达到 0.4~0.6 时，立即停止培养，迅速将摇瓶置于冰浴中剧烈摇晃 1~2min，使菌液快速降温至 0~4℃，并继续冰浴静置 10min，终止菌体生长。此步骤为制备成败的核心，OD₆₀₀值绝对不可超过 0.6，超过后菌体进入对数生长后期或平台期，细胞膜通透性下降，感受态转化效率会大幅骤降；必须全程快速控温，维持菌体的最佳生理状态。

低温无菌收菌：将冰浴后的菌液全部转移至提前预冷的 50mL 无菌离心管中，在 4℃条件下，3000g 离心 10min。离心完成后，弃尽上清，将离心管倒扣在无菌吸水纸上 1min，完全沥干管内残留的培养基，避免残留培养基影响后续 Ca²⁺的诱导效果。此步骤需严格控制离心转速与时间，转速过高、时间过长会导致菌体破裂失活，全程温度必须维持在 0~4℃。

第三阶段：Ca²⁺诱导，感受态细胞制备（全程冰上操作）

次 CaCl₂洗涤与孵育：向每管菌体沉淀中加入 30mL 提前冰浴预冷的 0.1mol/L CaCl₂溶液，用无菌移液管轻柔吹打菌体，使沉淀完全重悬，严禁剧烈涡旋震荡，避免对细胞膜造成机械损伤。菌体完全重悬后，冰浴静置 30min，使 Ca²⁺充分结合细胞膜磷脂双分子层，诱导细胞膜通透性发生改变，为后续质粒转化奠定基础。孵育完成后，在 4℃条件下，3000g 离心 10min，弃尽上清，沥干管内残留液体。

第二次 CaCl₂浓缩与冻存液重悬：向每管菌体沉淀中加入 2mL 提前冰浴预冷的 CaCl₂- 甘油冻存液，用枪头轻柔吹打，直至菌体完全重悬，无肉眼可见的菌块，菌液均匀浑浊。重悬完成后，冰浴静置 15min。若需进一步提升转化效率，可将重悬后的菌液置于 4℃冰箱静置 12~24h，此低温静置处理可使转化效率提升 2~5 倍。

第四阶段：分装与超低温冻存

无菌分装：在超净台内、全程冰浴的状态下，将重悬好的感受态细胞悬液，按 50μL 或 100μL 每管的体积，快速分装至提前预冷的 1.5mL 无菌 EP 管中，分装完成后立即盖紧管盖。此步骤需控制分装速度，避免感受态细胞在室温下长时间放置；单管分装体积需匹配单次实验的用量，杜绝后续使用时反复冻融。

超低温冻存：分装完成后，立即将所有分装好的感受态细胞管转移至 - 80℃超低温冰箱中冻存，严禁置于 - 20℃冰箱保存，-20℃环境会导致细胞冰晶破裂，完全丧失转化活性。合格批次的感受态细胞，在 - 80℃条件下可稳定保存 6~12 个月。

第五阶段：必做质控验证（确认感受态细胞合格可用）

无菌与本底污染检测：取 1 管制备好的感受态细胞，冰上融化后，分别取 100μL 菌液涂布无抗 LB 平板和氨苄青霉素抗性 LB 平板，37℃倒置培养 16~20h。无抗平板上无菌落生长，说明整批感受态无杂菌污染；抗性平板上无菌落生长，说明宿主菌无自发抗性突变，本底干净，无假阳性风险。若任一平板出现菌落，整批感受态细胞需全部废弃。

转化效率测定（核心质控指标）：取 50~100μL 感受态细胞，冰上融化后加入 10pg~1ng 的 pUC19 超螺旋标准质粒，轻柔混匀后冰浴 30min；42℃热激 90s，立即冰浴 2min；加入无抗 SOC 或 LB 培养基，37℃、200rpm 振荡复苏 1h；将菌液做梯度稀释后，取 100μL 涂布氨苄青霉素抗性 LB 平板，37℃倒置培养 16~20h。选择菌落数在 30~300 个之间的平板进行计数，按公式计算转化效率：转化效率（CFU/μg DNA）= 菌落数 × 稀释倍数 × 1000 / 加入质粒的质量（ng）。常规化学法制备的感受态细胞，转化效率≥1×10⁸ CFU/μg 为合格，可满足常规实验需求；若转化效率低于阈值，说明细胞状态不合格，不建议用于正式实验。

活菌率检测（可选）：可通过美蓝染色镜检检测活菌率，活细菌不会被美蓝染色，死细菌会被染为蓝色，活菌率≥95% 为合格批次。

三、关键注意事项

全程操作必须维持无菌环境，所有操作均需在超净台内完成，避免杂菌污染导致整批制备失败。

低温控制贯穿全程，除菌体振荡培养环节外，其余所有步骤均需在 0~4℃冰浴条件下完成，严禁感受态细胞在室温下长时间放置，避免细胞膜结构恢复，丧失感受态特性。

不同大肠杆菌菌株的收菌 OD₆₀₀值存在差异，制备特定菌株时，需提前绘制菌株生长曲线，确定最佳收菌时间，保证菌体处于对数生长早 - 中期的最佳状态。

感受态细胞分装后需立即冻存，严禁反复冻融，反复冻融会导致细胞内形成冰晶，破坏细胞膜结构，转化效率会急剧下降。