双荧光素酶报告基因检测是以荧光素(luciferin) 为底物来检测萤火蛟光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化Iuciferin氧化成oyluciferin, 在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence) ，可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，常应用于启动子转录活性调控及miRNA靶基因验证等向研究。

双荧光素酶通常是指萤火蛟光素酶和海肾荧光素。其中荧火蛟光素是从甲虫(Photinuspyralis)中分离得到，分子量为61kDa;而海肾(Renilla) 荧光素酶则是从海肾(Renillareniformis)中分离,分子量为36kDa。这两种酶的区别之一是他们的底物和辅因子不同:萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、 ATP和镁离子同时存在才能发光;而海肾荧光素酶仅需要腔肠素(coelenterazine)和氧气。萤火荧光素酶和海肾荧光素酶的区别之二是发光的颜色不同:萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色,波长550-570nm;而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双报告实验中得到广泛应用。

双荧光素酶报告基因检测优势:单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的”对照”作为内参为试验提供-基准线, 从而可以在一定程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。双荧光素酶报告基因检测常用的载体有两种策略。一种是两种荧光素分别位于两个载体上,第二种是两种荧光素酶位于同一个载体上。以一种为例，这两种载体分别为pMIR REPORT miRNA载体和pRL-TK载体。经检索发现，pMIR-REPORT miRNA载体是由Ambion开发的载体，它用来克隆插入miRNA靶序列，评估细胞内miRNA功能的载体。

另外的一个载体是pRL-TK载体，这个载体是由Promega开发的，pRL-TK是海肾荧光素酶报告载体，含有SV40增强子，pMIR-REPORT miRNA这个载体主要是用于评估miRNA与靶基因3’UTR的结合，靶基因的3’UTR放在荧光素酶的后面，这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶，而pRL-TK这个载体则表达海肾荧光素酶，将这两个质粒共同转染进入293细胞中来检测荧光时，pRL-TK这个质粒起到一个内参的作用。