一、实验准备

TILs提取培养试剂盒（abs90045）

需要额外准备的试剂及耗材

试剂到货处理：

1）TIL细胞扩增培养基A 、TIL细胞激活培养基B在4℃可保存3个月，收到货后4℃保存，建议1个月内使用完毕，长期不用建议放于-20℃储存，避免反复冻融超过2次；

2）组织保存液G、组织消化液C内含有维持细胞活性营养成分，为了保持试剂营养成分的活性，长期不用建议放于-20℃储存，避免反复冻融超过2次。

二、操作步骤与方法：

1 组织前处理

1.1 实验材料

需提前准备缓冲液F（4℃预冷）、组织保存液G、取样管、组织运输箱、冰袋

1.2 组织的获取与运输

● 组织的取样与运输是TIL提取成功的一个环节也是最容易忽视的环节，若组织前期保存不当会导致细胞活性差、污染、正常细胞少等问题，降低TIL提取成功率；

● 组织应在离体的30min内放入组织保存液G，缓冲液F清洗3-5次，将组织表面血液冲洗干净，放入组织保存液G中，取样管于4℃低温保存运输（72h内）。

2 TIL细胞提取

2.1 实验材料

需提前准备缓冲液F(4℃)、组织消化液C(37℃)、分离液D、分离液E、TIL扩增培养基A、TIL激活培养基B（室温或37℃）、镊子(10cm)、尖头眼科手术剪/手术刀片、一次性60mm培养皿、1.5 mL/15mL/50mL离心管、100μm细胞滤网、3mL无菌巴氏吸管/移液枪、24孔细胞培养板、金属冰盒。

2.2 组织的处理

取材后的组织建议在2-8℃条件下保存运输，快速转运至洁净实验室进行TIL提取实验流程，组织拍照并登记详细信息。

2.2.1 组织的清洗

取样管消毒后，在超净台中将组织取出来，放入培养皿中，加入缓冲液F，用3mL巴氏吸管或1000μL移液枪吹打清洗，重复清洗操作三次及以上。

2.2.2 组织的解离与消化

用眼科剪或手术刀片去除组织杂质，镊子转移至1.5mL EP管中，用眼科剪进一步将组织机械解离成体积约为1-3mm³的组织块，转移至15mL EP管中，加入8mL组织消化液37℃震荡消化60min。消化过程每20min显微镜下观察组织消化情况，取少量消化液在显微镜下观察，观察到较多的单个细胞后进行下一步操作。

2.2.3 组织的过滤

加入3倍体积的缓冲液F终止消化，消化完成组织通过100μm孔径的细胞筛网过滤，收集滤液。

2.3 TIL细胞分离

按顺序依次添加TIL分离液D 2mL，分离液E 4mL于15mL离心管，再沿离心管壁轻轻加入组织滤液6mL，2000转离心20min，收集D分离液界面上的细胞，该层富含TIL细胞的悬液，离心1500转10min。分离液E的界面层主要为肿瘤细胞。再用缓冲液F清洗TIL细胞洗2次，以除去细胞分离液，得到TIL细胞沉淀。如果此时不进行细胞激活及扩增，可选择合适的TIL细胞量进行程序降温冻存。

3 TIL细胞激活扩增培养（以24孔板为例）

3.1 实验材料

需提前准备缓冲液F(4℃)、TIL扩增培养基A，TIL激活培养基B（室温或37℃）、15mL/离心管、3mL无菌巴氏吸管/移液枪、24孔细胞培养板。

3.2 TIL细胞激活

● 将分离好的TIL细胞计数；

● TIL细胞激活培养基B重悬TIL细胞（浓度200000cell/mL），每孔添加1.5mL TIL细胞激活培养基B，连续激活48h。

3.3 TIL细胞扩增

● 激活后的TIL细胞，缓慢沿细胞板侧壁吸取TIL细胞激活培养基B（注意：不要吸取细胞）；

● 每孔添加1.5mL TIL细胞扩增培养基A连续扩增培养；

● 在连续培养第4天（此时可观察到T细胞明显成团），缓慢沿细胞板侧壁吸取TIL细胞扩增培养基A，添加新鲜TIL细胞扩增培养基A，连续培养5天（此时可观察到大量T细胞明显成团悬浮于培养基内）；

● 培养后的细胞也可进行流式分选鉴定。

4 TIL细胞传代（以24孔板为例）

将悬浮于培养基内的T细胞团收集于15mL离心管，1000转离心5min，细胞计数（浓度为200000cell/mL）。TIL细胞扩增培养基A重新接种24孔细胞培养板。根据接种密度不同48-72h可完成扩增。

5 TIL细胞冻存

5.1 实验材料

传代缓冲液F(4℃)、TIL冻存液H(4℃)、15mL离心管、细胞冻存管、程序降温盒、移液枪

5.2 冻存步骤

将悬浮于培养基内的T细胞团收集于15mL离心管，1000转离心5min，细胞计数，添加TIL冻存液H（浓度为5000000cell/mL），转移至细胞冻存管内，进行程序降温。

6 TIL细胞复苏（以24孔板为例）

TIL细胞的复苏分两种情况，一种是TIL细胞提取以后，立即冻存，后续复苏需要激活；一种是TIL细胞激活扩增后冻存，后续复苏不需要激活。

6.1 TIL细胞提取之后立即冻存，复苏需要激活，步骤如下：

6.1.1 实验材料

缓冲液F、TIL细胞扩增培养基A、 TI细胞L激活培养基B、24孔细胞培养板、15mL离心管、水浴锅、3mL无菌巴氏吸管/移液枪。

6.1.2 复苏步骤

● 取15mL离心管，添加8mL缓冲液F待用；

● 从低温环境中取出冻存的细胞，快速置于37℃水浴锅中融解，水浴融解过程中，需轻轻摇动冻存管，以确保冻存液在短时间内完全融解。将解冻后的T细胞快速转移至15mL离心管，使用移液枪轻柔吹打6-8次，1000转离心5min弃上清。将T细胞沉淀计数，添加合适的TIL细胞激活培养基B混匀（浓度500000cell/mL），每孔添加1.5mL混合液于24孔细胞培养板内观察培养48h；

● 激活后的TIL细胞，缓慢沿细胞板侧壁吸取TIL细胞激活培养基B（注意：不要吸取细胞）；

● 每孔添加1.5mL TIL细胞扩增培养基A连续扩增培养；

● 在连续培养第4天（此时可观察到T细胞明显成团），缓慢沿细胞板侧壁吸取TIL细胞扩增培养基A，添加新鲜TIL细胞扩增培养基A，连续培养5天（此时可观察到大量T细胞明显成团悬浮于培养基内）；

● 培养后的细胞也可进行流式分选鉴定。

6.2 TIL细胞激活扩增后冻存，后续复苏不需要激活，步骤如下：

6.2.1 实验材料

缓冲液F、 TIL细胞扩增培养基A、24孔细胞培养板、15mL离心管、水浴锅、3mL无菌巴氏吸管/移液枪

6.2.2 TIL细胞复苏培养

● 取15mL离心管，添加8mL缓冲液F待用；

● 从低温环境中取出冻存的细胞，快速置于37℃水浴锅中融解，水浴融解过程中，需轻轻摇动冻存管，以确保冻存液在短时间内完全融解。将解冻后的T细胞快速转移至15mL离心管，使用移液枪轻柔吹打6-8次，1000转离心5min弃上清。将T细胞沉淀计数，添加合适的TIL细胞扩增培养基A（浓度500000cell/mL）混匀，每孔添加1.5mL混合液于24孔细胞培养板内观察培养。

今天讲解就到这了，大家如有细胞培养问题，欢迎一起交流哦！

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