5’-核苷酸酶活性检测试剂盒（可见分光光度法）
产品货号: BA1641
产品规格: 50T
产品简介：
5＇-核苷酸酶(5＇-NT)是一种对底物特异性不高的水解酶，可作用于多种核苷酸。广泛存在于各种植物、动物组织、 血清血浆中。5＇-NT是一种特殊的磷酸酯水解酶，它只作用于核苷-5＇-磷酸如AMP(腺苷-5＇-磷酸或腺苷酸)生成无机 磷酸和核苷。通过定磷显色法测定所生成的无机磷含量，可以计算出5＇-NT的活性高低。
注意：实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
产品组成：
产品名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体30ml×1瓶 | -20℃ |
试剂一 | 粉剂×2支 | -20℃ |
试剂二 | 液体12ml×2瓶 | 4℃ |
试剂三 | 液体30ml×1瓶 | 4℃ |
试剂四 | 液体25ml×1瓶 | 4℃ |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 4℃ |
试剂六 | 粉剂×1瓶 | 4℃ |
试剂七 | 液体12ml×1瓶 | 室温 |
标准品 | 粉剂×1瓶 | 4℃ |
溶液的配制：
1. 试剂五：临用加入12 mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂4℃保存两周。
2. 试剂六：临用加入12 mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂4℃保存两周。
3. 工作液配制：临用取1支试剂一中加入到1瓶试剂二中充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存一周， 现用现配。
4. 定磷试剂的配制：按H2O：试剂五：试剂六：试剂七=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。 若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
5. 标准品：8mg磷标准品。临用加入4.6mL试剂四溶解配制成10μmol/mL的标准溶液，溶解后4℃保存两周。
需自备的仪器和用品：
天平、可见分光光度计、台式离心机、低温离心机、恒温水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移 液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤（仅供参考）：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照质量（g）﹕提取液体积(mL)为1﹕5-10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液），冰上匀浆后于4℃，15000g离心10min，取上清置于冰上待测。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）﹕蒸馏水体积（mL）为500-1000﹕1的比例（建议500万个细胞加入1mL提取液）， 冰浴超声波破碎细胞（功率300W，超声3s，间隔7s，总时间3min）；然后4℃，15000g离心10 min，取上清置于冰上待测。
3. 血清：直接检测。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2. 将标准品用试剂四稀释至0.48、0.24、0.12、0.06、0.03、0.015μmol/mL标准液。
3. 操作表（在1.5 mL EP管中操作）
（1）酶促反应
试剂名称（μl） | 测定管 | 对照管 |
样本 | 100 | 100 |
工作液 | 400 | |
漩涡混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（植物及其他）反应30 min |
试剂三 | 500 | 500 |
工作液 | - | 400 |
（2）显色反应
试剂名称（μl） | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
上清液 | 400 | 400 | - | - |
标准管 | - | - | 400 | - |
试剂四 | - | - | - | 400 |
定磷试剂 | 800 | 800 | 800 | 800 |
漩涡混匀，40℃显色10min；取1mL反应液于1mL玻璃比色皿中，在660 nm下测定吸光值A，分别记为A测定、A对照、A标准、A空白，计算ΔA标准=A标准-A空白，ΔA测定=A测定-A对照（空白管只需测定1-2次）。 |
三、5＇-NT活性计算
标准曲线的绘制： 以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y= kx+b，将ΔA带入方程得到x（μmol/mL）。
5＇-NT 活性的计算
（1）按样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
5＇-NT酶活（U/mg prot）=x×V反总÷(V样×Cpr)÷T×103=333.3×x÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活单位定义：每克组织在反应体系中每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活单位。
5＇-NT酶活（U/g质量）=x×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×103=333.3×x÷W
（3）按细胞数计算：
酶活单位定义：每104个细胞在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
5＇-NT酶活（U/104 cell）=x×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T×103=333.3×x÷细胞数量
（4）按液体体积计算：
酶活单位定义：每毫升液体在反应体系中每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
5＇-NT酶活（U/mL）=x×V反总÷V样÷T×103=333.3×x
V样：酶促反应中加入样本体积，0.1mL；V反总：酶促反应总体积，1mL；V样总：加入提取液的体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；细胞数量：以万计；T：酶促反应时间，30 min；103：单位换算，1μmol=103nmol。
注意事项:
1. ΔA测定大于1或者A测定管大于1时，建议将样本用试剂四稀释后再进行测定。
实验实例：
1. 取0.1g小鼠肝，进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.723- 0.534=0.189，带入标准曲线y=2.3928x+0.0165，计算x=0.0721，按照样本质量计算酶活得：
5＇-NT酶活（U/g质量）=333.3×x÷W=333.3×0.0721÷0.1=240.31 U/g 质量。
2. 取0.1g稗草，进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.367-0.281=0.086， 带入标准曲线y=2.3928x+0.0165，计算x=0.0290，按照样本质量计算酶活得：
5＇-NT酶活（U/g质量）=333.3×x÷W=333.3×0.0290÷0.1=96.657 U/g质量。
版权声明