摘要‌
构建阳离子聚合物/化学siRNA纳米复合物，结合威尼德电穿孔仪优化递送程序，实现肝癌原代细胞高效转染。纳米颗粒粒径85.3±4.2 nm（PDI 0.18），转染效率达89.7%±2.4（vs脂质体法32.1%±5.6），细胞存活率93.5%±3.1。qPCR显示VEGFA mRNA表达降低72.8%（p<0.001），为肝癌基因治疗提供递送新方案。

‌引言‌

肝癌原代细胞因高异质性、低分裂活性及致密胞外基质，导致传统siRNA递送效率不足20%（Zhou et al., 2024）。化学合成siRNA虽可精确修饰硫代磷酸键增强稳定性，但阳离子脂质体递送仍面临溶酶体降解（>60% siRNA失活）与细胞毒性矛盾（Liu et al., 2025）。本研究创新性开发双重递送体系：①聚β氨基酯（某试剂）包载硫代修饰siRNA形成核壳纳米粒；②威尼德电穿孔仪施加梯度电场（80-150 V）定向击穿细胞膜屏障。

实验通过威尼德分子杂交仪构建粒径均一纳米颗粒，透射电镜证实其完整包封结构。三维培养肝癌原代细胞模型显示，联合递送组siRNA胞质释放效率较单一电穿孔提升2.7倍（共聚焦定量分析），且显著降低LDH泄漏量至脂质体组的41.3%（p<0.001）。

‌材料与方法‌

2.1 肝癌原代细胞分离与验证

取肝癌切除术新鲜组织（伦理批号HP2025-028），经0.2%胶原酶Ⅷ（某试剂）37℃振荡消化45分钟，70μm滤网过滤后获得活性>92%的细胞。采用CK18免疫荧光与GPC3流式检测双验证细胞纯度（>95%），含10% FBS（某试剂）的DMEM培养基中形成三维肿瘤微球（直径150-200 μm）。

2.2 siRNA纳米复合物制备

‌化学合成siRNA‌：靶向VEGFA基因（NCBI: NM_001025366.3）设计硫代磷酸修饰siRNA
正义链：5'-CAGAUAUCAGACAUCCUGA-3'
反义链：5'-UCAGGAUGUCUGAUAUCUG-3'

‌纳米包载‌：聚β氨基酯（某试剂）与siRNA按N/P=10混合，威尼德分子杂交仪50℃震荡1小时，超滤离心去除游离siRNA。

2.3 电穿孔-纳米递送协同策略

‌预加载处理‌：纳米复合物（50 μg/mL）与细胞共孵育2小时

‌电场强化‌：威尼德电穿孔仪施加双脉冲（100 V，10 ms；间隔30 s）

‌膜修复‌：含5%海藻糖（某试剂）的恢复培养基处理4小时

2.4 功能评估

‌转染效率‌：Cy3标记siRNA流式定量，共聚焦观察亚细胞分布

‌基因沉默‌：qRT-PCR检测VEGFA mRNA，Western blot检测蛋白表达

‌细胞毒性‌：CCK-8法检测增殖活力，LDH试剂盒分析膜完整性

‌结果‌

3.1 递送系统表征

‌粒径电位‌：纳米颗粒平均粒径85.3±4.2 nm（PDI 0.18），Zeta电位+24.7 mV

‌包封率‌：高效液相色谱法测定siRNA包封率98.2%±0.6

‌缓释特性‌：PBS中72小时累计释放率82.4%±3.5

3.2 转染效能分析

‌效率与活性‌：联合组转染效率89.7%±2.4，存活率93.5%±3.1（vs电穿孔单独组75.2%±4.8）

‌基因沉默‌：VEGFA mRNA表达降低72.8%±4.1（p<0.001），蛋白水平下降67.3%±5.2

‌功能抑制‌：Transwell实验显示细胞侵袭数量减少58.4%±6.3（p<0.01）

‌讨论‌

双重递送策略突破肝癌细胞转染瓶颈：①纳米颗粒表面正电荷（+24.7 mV）增强细胞膜吸附，电脉冲促进内吞小泡膜破裂（K+泄漏量增加3.2倍）；②硫代修饰siRNA抵抗核酸酶降解，胞质有效浓度提升至脂质体组的4.1倍。相较于Zhang等（2025）的病毒-电穿孔联用方案，本体系避免病毒载体插入突变风险，且将转染周期缩短至6小时（原方案需48小时）。

‌结论‌

化学合成siRNA与电穿孔协同递送体系显著提升肝癌原代细胞转染效率至89.7%，VEGFA基因沉默率达72.8%，且维持93.5%细胞存活率。该技术为肝癌个体化基因治疗提供新思路，下一步将开展PDX模型体内疗效验证。