猪肉中己烯雌酚残留检测方法－

酶联免疫吸附测定(ELISA)法

猪肉中己烯雌酚残留检测方法－

酶联免疫吸附测定(ELISA)法

范围

本标准规定了猪肉中己烯雌酚残留量检测的制样和酶联免疫吸附测定法。

本标准适用于猪肉中己烯雌酚的残留量的快速筛选检测。对于可疑样品需用确证法确认。

规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的版本。凡是不注日期的引用文件，其版本适用于本标准。

GB/T 1.1-2000 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则 (ISO/IEC Directives, Part 3, 1997, Rules for the structure and drafting of International Standards, NEQ)

GB/T 6682-1992 分析实验室用水规则和试验方法

农牧发[2003]1号 兽药残留试验技术规范（试行）

制样

样品的制备

取适量新鲜或冷冻的空白或供试猪肉组织，绞碎并之使均匀，密封。

样品的保存

-20℃以下冰箱中贮存备用。

测定方法

方法提要或原理

猪肉中残留的己烯雌酚用叔丁基甲基醚提取，酶联免疫吸附测定法测定,其基本原理是抗原抗体反应。酶标板的微孔包被有偶联抗原，标样或样品中的己烯雌酚与微孔中预包被的偶联抗原竞争己烯雌酚特抗体。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标记抗原。加入底物液，结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液，在450nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中己烯雌酚浓度呈反比。

试剂和材料

以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的二级水。

叔丁基甲基醚

乙腈

正己烷

己烯雌酚试剂盒（采用*备案的试剂盒）

4.2.6.1 己烯雌酚系列标准溶液 0ng/mL 、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL

4.2.6.2 酶标板8条×12孔，包被有偶联抗原

4.2.6.3 酶标记物

4.2.6.4 己烯雌酚抗体 临用前将抗体用稀释了的复溶液按1：11倍稀释（50mL抗体加500mL复溶液）成的己烯雌酚抗体溶液

4.2.6.5 底物溶液A

4.2.6.6 底物溶液B

4.2.6.7 浓缩洗涤液 临用前用水将其稀释20倍作为洗涤液

4.2.6.8 浓缩复溶液 临用前用水将其稀释5倍作为稀释了的复溶液

4.2.6.9 终止溶液

仪器和设备

CSY-E96Y己烯雌酚残留检测仪

天平 感量0.01g

分析天平 感量0.00001g

漩涡混合仪

振荡器

组织匀浆机

冷冻离心机

氮吹仪

离心管 20mL、50mL

微量移液器 单道20mL，50mL，100mL，1000mL；多道50～250mL

测定步骤

试料的制备

试料的制备包括：

• 取绞碎后的供试样品,作为供试试料。
• 取绞碎后的空白样品,作为空白试料。
• 取绞碎后空白样品,添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。

提取和净化

取10000r/min匀浆1min的试料（5±0.05）g，置50mL离心管中，加15mL叔丁基甲基醚，涡旋1min，振荡10min，6000r/min，在-4℃下离心10min，将上层清夜移至鸡心瓶中。再加15mL叔丁基甲基醚同法操作，合并两次上清液，于45℃水浴中减压旋转蒸发至干。

加2mL乙腈于鸡心瓶中，旋涡溶解残留物，然后将其转移至20mL离心管中，再加2mL乙腈同法操作，转移至同一离心管中。在离心管中加5mL正己烷，涡动60s，15℃，6000 r/min下离心5min，弃去上层液体，再加5mL正己烷于离心管中同法操作，取下层液体，60℃下氮气吹干，加入1mL稀释后的复溶液，涡动60s后取50mL加入200mL稀释后的复溶液，涡动60s，即可作为试样供分析。

样品测定程序（20℃～26℃条件下操作）

4.4.3.1 使用前将试剂盒置于室温（20℃～26℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2℃～8℃。将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。

4.4.3.2 加入50 mL标准溶液或试样溶液到微孔底部，每孔再加入50 mL己烯雌酚抗体溶液，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，25℃环境中反应30min。

4.4.3.3 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250mL洗涤液，10s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。

4.4.3.4 加入100mL酶标记物到微孔底部，用盖板膜封板，25℃环境中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次。

4.4.3.5 加入50mL底物液A和50mL底物液B到微孔中，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色15min。

4.4.3.6 加入50mL终止液到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值（OD值）。

结果计算和表述

所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以*个标准（0标准）吸光度值的平均值再乘以100%，

得到以百分比给出的吸光度值，以式（1.1）表示：

百分吸光度值= ×100% ……………………………………………………… 1.1

式中:

B—为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；

B₀—为零浓度标准溶液的平均吸光度值。

以标准溶液中己烯雌酚浓度(ng/mL)的自然对数为X轴，百分吸光度值为Y轴，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度（ng/mL）可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲线的方程，计算未知样品中己烯雌酚的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中己烯雌酚的浓度。

注：检测结果小于1.0μg/ kg时，可判为未检出，大于1.0μg/ kg时，判为可疑，需用确证法确认。

检测方法灵敏度、准确度、精密度

灵敏度

本方法在猪肉中的zui低检出限为1.0μg/kg。

准确度

本方法在猪肉中1.0μg/kg～4.0μg/kg添加浓度的回收率为60.0%～120.0%。

精密度

本方法的批内变异系数CV≤22%； 批间变异系数CV≤15%。

己烯雌酚残留检测仪技术参数：

☆波长范围:300nm-1000nm

☆波长准确度:±2nm

☆吸光度范围: 0.000~4.000ABS

☆分辨率 :0.001Abs

☆稳定性 : ±0.001A/hr

☆透射比重复性: ≤0.5%T

☆光源 : 进口LED

☆样品池 : 微孔板